Khả Năng Sinh Trưởng Tiếp Theo Của Cây Salem In Vitro Nuôi Cấy Trên Môi Trường

ở nồng độ thấp thì hệ rễ sẽ chậm phát triển do thiếu Fe hoặc ở nồng độ cao thì sự phân bố của nano trên bề mặt rễ quá nhiều làm giảm sự hấp thu nước và chất dinh dưỡng của rễ; từ đó rễ phải phát triển mạnh và xuất hiện nhiều lông hút nhằm mục đích cải thiện khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây. Mặt khác, ở nồng độ cao thì cây cũng sinh trưởng và phát triển chậm khi rễ không hút được khoáng chất trong môi trường nuôi cấy. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Martínez-Fernández và cộng sự (2016) về sự sụt giảm các nguyên tố đa lượng (Ca, K, Mg và S) khi nghiên cứu tác động của FeNPs lên cây hoa hướng dương (Helianthus annuus) [104]. Ngược lại, cũng có nhiều nghiên cứu cho thấy nếu các hạt nano có kích thước nhỏ hơn 50 nm thì chúng có thể được hấp thu và vận chuyển dễ dàng trong cây [48, 67, 98]. Bên cạnh đó, hàm lượng chlorophyll giảm được ghi nhận ở các nghiệm thức được thay thế Fe-EDTA nồng độ thấp hoặc cao. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Racuciu và Creagna (2007) về ảnh hưởng của FeNPs phủ tetramethyl ammonium hydroxide lên sự phát triển ở cây ngô (Zea mays). Kết quả cho thấy ở nồng độ cao (100 – 250 µl/L), dung dịch FeNPs này làm giảm hàm lượng cholorophyll a [126]. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Trujillo-Reyes và cộng sự (2014), Wang và cộng sự (2011) khi nghiên cứu sự hấp thu FeNPs trên cây rau diếp (Lactuca sativa) [157], lúa mạch (Lolium perenne) và cây bí ngô (Cucurbita mixta) [165]. Một điều đáng lưu ý là nồng độ FeNPs sử dụng trong nghiên cứu này, ở nồng độ cao sẽ gây ức chế đến hệ rễ và sự sinh trưởng, phát triển của cây dâu tây; hoặc thúc đẩy quá trình tạo phôi ở cây sâm Ngọc Linh và không tạo được cây con hoàn chỉnh do phần thân đã bị rụi và tập trung cho quá trình tạo phôi, nên kết quả thu được chiều cao cây sâm Ngọc Linh chỉ đạt 2,93 cm.

Vì vậy, các chồi cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh được nuôi cấy trên môi trường MS cải biên ở nồng độ FeNPs thấp hoặc quá cao đều ảnh hưởng đến chất lượng cây giống. Đây là hiện tượng đặc trưng chứng tỏ cây bị thiếu hụt Fe hoặc dư thừa Fe đã được Eskandari (2011) mô tả khi nghiên cứu về vai trò và cơ chế hấp thu Fe của thực vật [55]. Thiếu Fe ảnh hưởng nhiều đến quá trình tổng hợp chlorophyll cũng như hệ thống các enzyme trong phản ứng oxy hoá khử và chuỗi vận chuyển điện tử [55]. Ở nghiệm thức thay thế Fe-EDTA bằng 2,8; 1,4; 5,6 mg/L FeNPs có hiệu quả

đáng kể đến quá trình ra rễ, sinh trưởng, phát triển và tạo cây con hoàn chỉnh lần lượt của cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro. Điều này có thể thấy ở các đối tượng khác nhau thì nhu cầu hấp thu Fe trong quá trình phát triển sẽ khác nhau; thường phụ thuộc vào kiểu gene hoặc chu kỳ sinh trưởng của từng loài. Đối với những loài có chu kỳ sinh trưởng ngắn như cây salem hoặc dâu tây thì chỉ cần một lượng FeNPs bằng ½ hoặc ¼ so với lượng Fe-EDTA trong môi trường đối chứng cũng đã đáp ứng đủ nhu cầu sinh trưởng và phát triển của thực vật, giúp tiết kiệm được chi phí trong sản xuất. Ở cây sâm Ngọc Linh có chu kỳ sinh trưởng dài hơn thì cần một lượng FeNPs lớn hơn nên cần thay thế một lượng FeNPs tương đương (5,6 mg/L) với lượng Fe-EDTA trong môi trường đối chứng. Kết quả cho thấy các cây này sinh trưởng, phát triển tốt hơn so với cây đối chứng và các nghiệm thức khác.

Các kết quả về hàm lượng AgNPs hấp thu và lượng khí ethylene tích luỹ trong thí nghiệm này cũng cung cấp các bằng chứng mới cho khả năng tương tác của AgNPs với cây trồng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Khí ethylene đã thể hiện một vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phát triển của thực vật. Các nghiên cứu cho rằng AgNPs hoạt động bằng cách thay thế các phân tử đồng ở các thụ thể nội bào làm mất liên kết giữa các phân tử khí ethylene với các thụ thể, ngăn chặn quá trình sinh khí ethylene trong bình nuôi cấy. Cụ thể trong nghiên cứu của chúng tôi nồng độ AgNPs tối ưu trong mỗi thí nghiệm là đủ để thay thế ở các thụ thể này giúp bão hoà hầu hết các phân tử khí ethylene dẫn đến sự hình thành rễ, sinh trưởng và phát triển tốt trên ba đối tượng nghiên cứu. Ở nồng độ cao hơn, các AgNPs có thể gây hại các mô, màng tế bào hoặc cũng có thể làm thúc đẩy quá trình sản xuất khí ethylene trong thực vật. Tuy nhiên, ngưỡng ethylene có thể thay đổi tuỳ theo loài hoặc tuổi của mẫu cấy.

Nhiều nhà khoa học đã chứng minh được tác dụng của ion Ag là chất ức chế tổng hợp ethylene trong nuôi cấy mô bằng cách ức chế hoạt động SAM [177] - là một tiền chất để tạo thành ethylene [106], hoặc làm mất liên kết ethylene và ngăn chặn các tín hiệu sinh ethylene của thực vật [176]. Hay trong một nghiên cứu khác cũng cho rằng AgNO3 là chất ức chế sinh tổng hợp của khí ethylene bằng cách các ion Ag tác động vào các thụ thể làm giảm liên kết giữa các thụ thể với phân tử khí ethylene [168], mục đích làm ngăn chặn các phản ứng ethylene diễn ra. Hay nghiên cứu của

Miyazaki và Yang (1987) đã báo cáo ảnh hưởng của các polyamine và AgNO3 có liên quan đến việc cùng sử dụng chung một tiền chất SAM trong phản ứng sinh khí ethylene, làm giảm lượng khí này sinh ra trong bình nuôi cấy [106]. Các nghiên cứu này được dự đoán là tương tự với nghiên cứu của chúng tôi về cơ chế tác động của Ag và các hợp chất của Ag lên thực vật nhằm giải thích cho mối quan hệ giữa Ag và khí ethylene.

Ở kích thước nano với những thay đổi về tính chất lý hóa, đặc trưng hứa hẹn việc giảm hoạt động của ethylene một cách mạnh mẽ. Điều này đã được chứng minh bằng nghiên cứu làm rõ cơ chế ức chế tổng hợp ethylene của AgNPs trong vi nhân giống cây do Sarmast và cộng sự (2015) thực hiện. Ông đã cho nhân bản gene TuACS của cây - gen tổng hợp ACC (tiền chất cuối trong con đường tổng hợp ethylene) và đánh giá biểu hiện gene với các nồng độ và thời gian bổ sung AgNPs khác nhau. Kết quả PCR ghi nhận được mức độ biểu hiện TuACS giảm đáng kể ngay cả ở nồng độ AgNPs thấp nhất. Một điều thú vị là tại nồng độ 60 mg/L AgNPs cho kết quả giảm biểu hiện gen tốt nhất, trong khi việc sử dụng 120 mg/L lại không có hiệu quả hơn so với 60 mg/L AgNPs [136]. Nhựt và cộng sự (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs trong khoảng nồng độ 0 – 20 mg/L lên sự tăng trưởng của một số loại cây trồng nuôi cấy in vitro có giá trị kinh tế cao của Việt Nam. Kết quả cho thấy AgNPs ở nồng độ 10 mg/L bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho sự sinh trưởng tốt nhất với đối tượng cây cúc (Chrysanthemum spp.) và dâu tây (Fragaria spp.), trong khi đó đối với đồng tiền (Gerbera jamesonii) là 5 mg/L [13].

Như vậy, AgNPs lần lượt ở các nồng độ 0,4; 0,5; 1,2 mg/L tương ứng trên cây salem và sâm Ngọc Linh và 2,8; 1,4; 5,6 mg/L FeNPs tương ứng trên cây salem và sâm Ngọc Linh là thích hợp nhất cho quá trình tạo cây in vitro hoàn chỉnh chuẩn bị cho giai đoạn thuần hoá ngoài vườn ươm.

KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG TIẾP THEO CỦA CÂY CON IN VITRO NUÔI CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG BỔ SUNG AgNPs VÀ THAY THẾ Fe- EDTA BẰNG FeNPs TỐI ƯU Ở GIAI ĐOẠN EX VITRO

3.4.1. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro

Để đánh giá hiệu quả tác động của AgNPs và FeNPs đến sự sinh trưởng và phát triển trên các đối nghiên cứu một cách hoàn chỉnh hơn, các cây con in vitro ở nồng độ tối ưu của các loại nano được tiếp tục chuyển ra trồng trong điều kiện ex vitro. Khả năng sống sót, thích nghi, tăng trưởng và phát triển của cây con được thể hiện thông qua các chỉ tiêu theo dõi trong Bảng 3.9, 3.10 và Hình 3.11.

Bảng 3.9. Khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây salem trong vỉ xốp sau 4 tuần nuôi trồng

AgNPs	FeNPs	(%)		(cm)	(cm2)	tươi (g)
0,0	0,0	71,33b	3,66c	6,96b	4,03b	2,50b	25,76b
0,4	-	89,00a	10,00a	9,83a	14,75a	4,23a	35,26a
-	2,8	72,00b	5,66b	7,10b	8,26b	2,73b	28,46b

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 195 trang tài liệu này.

Nano (mg/L) Tỷ lệ sống

Số lá

Chiều cao cây

Diện tích lá

Khối lượng

Chlorophyll (nmol/cm2)

Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức = 0,05 trong phép thử Duncan.

Các cây con salem ở nồng độ 0,4 mg/L AgNPs không ghi nhận được hiện tượng cây chết sau 1 tuần nuôi cấy; ngược lại, cây có hiện tượng héo, rễ không phát triển và có nhiều cây bị chết làm xuất hiện nấm phấn trắng ở nồng độ 2,8 mg/L FeNPs và đối chứng (không bổ sung AgNPs và không thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs).

Sau 4 tuần chăm sóc dưới cùng một điều kiện, kết quả ghi nhận các cây con ở nồng độ 0,4 mg/L AgNPs thích nghi, sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với 2,8 mg/L FeNPs và đối chứng. Tỷ lệ sống (89,00%), số lá (10,00), chiều cao cây (9,83 cm), diện tích lá (14,75 cm2), khối lượng tươi (4,23 g) và chỉ số chlorophyll (35,26 nmol/cm2) ở nồng độ 0,4 mg/L AgNPs cao hơn so 2,8 mg/L FeNPs (lần lượt là

72,00%; 5,66; 7,10 cm; 8,26 cm2; 2,73 g và 28,46 nmol/cm2) và đối chứng (lần lượt

là 71,33%; 3,66; 6,96 cm; 4,03 cm2; 2,50 g và 25,76 nmol/cm2).

Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và phát triển của cây salem trong chậu nhựa sau 12 tuần nuôi trồng

Nano (mg/L) Số lượng

AgNPs	FeNPs		(cm)			(g)
0,0	0,0	10,66c	46,00c	66,00b	2,33b	28,93c
0,4	-	16,66a	85,00a	88,66a	4,33a	61,53a
-	2,8	14,33b	62,00b	71,33b	2,66b	35,26b

cành

Chiều cao hoa

Số lượng dé/cành

Số lượng hoa/dé

Khối lượng tươi hoa

Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức = 0,05 trong phép thử Duncan.

Các cây này tiếp tục được chuyển ra chậu lớn hơn để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển. Kết quả cho thấy ở giai đoạn này các cây con đã trải qua giai đoạn thích nghi và không còn chết nữa. Cây con ở nồng độ 0,4 mg/L AgNPs vẫn cho thấy quá trình sinh trưởng và phát triển chiếm ưu thế hơn (cây to, cao; lá dài, rộng, dày, hệ rễ phát triển mạnh) so với 2,8 mg/L FeNPs và đối chứng. Đặc biệt, các cây con ở nồng độ 0,4 mg/L AgNPs cho ra hoa sớm hơn (ở tuần thứ 6) so với FeNPs và đối chứng (ở tuấn thứ 9). Bên cạnh đó, kết quả ghi nhận cho thấy các cây con ở nồng độ 2,8 mg/L FeNPs có tốc độ sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với đối chứng nhưng quá trình ra hoa lại cùng nhau. Số lượng và chất lượng hoa ở nồng độ 0,4 mg/L AgNPs so với 2,8 mg/L FeNPs và đối chứng có sự khác biệt đáng kể sau 12 tuần nuôi trồng trong chậu nhựa. Số lượng cành (16,66), chiều cao hoa (85,00 cm), số lượng dé/cành (88,66), số lượng hoa/dé (4,33), khối lượng tươi (61,53 g) ở nồng độ 0,4 mg/L AgNPs cao hơn so với 2,8 mg/L FeNPs (lần lượt là 14,33; 62 cm; 71,33; 2,66; 35,26 g) và

đối chứng (lần lượt là 10,66; 46,00 cm; 66,00; 2,33; 28,93 g). Những điều trên cho thấy khả năng cải thiện hiệu quả trong việc thích nghi, sinh trưởng và phát triển của cây salem có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro có bổ sung 0,4 mg/L AgNPs.

Hình 3.11. Sự thích nghi, sinh trưởng và phát triển của cây salem sau 4 tuần và 12 tuần nuôi trồng

a1: cây có nguồn gốc từ nghiệm thức không bổ sung AgNPs và không thay thế FeNPs bằng FeNPs; a2: cây có nguồn gốc từ nghiệm thức bổ sung 0,4 mg/L AgNPs; a3: cây có nguồn gốc từ nghiệm thức thay thế FeNPs bằng 2,8 mg/L FeNPs sau 4 tuần nuôi trồng. b1: cây có nguồn gốc từ nghiệm thức không bổ sung AgNPs và không thay thế FeNPs bằng FeNPs; b2: cây có nguồn gốc từ nghiệm thức bổ sung 0,4 mg/L AgNPs; b3: cây có nguồn gốc từ nghiệm thức thay thế FeNPs bằng 2,8 mg/L FeNPs sau 12 tuần nuôi trồng.

3.4.2. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây dâu tây in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro

Cây dâu tây là loài rất nhạy cảm với nấm nên quá trình thuần hoá ở giai đoạn vườn ươm rất khó khăn đòi hỏi quá trình chăm sóc phải rất kỹ và cẩn thận. Các cây con ở 1,4 mg/L FeNPs cho sự thích nghi nhanh hơn so với 0,5 mg/L AgNPs và đối chứng (không bổ sung AgNPs và không thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs) sau 1 tuần nuôi cấy. Sau 4 tuần được nuôi trồng trong vỉ xốp ở điều kiện vườn ươm, kết quả ghi nhận tỷ lệ sống (86,00%), số lá (8,66), chiều cao cây (11,33 cm), diện tích lá (3,24 cm2), khối lượng tươi (8,86 g), chỉ số chlorophyll (39,90 nmol/cm2) cao hơn so với 0,5 mg/L AgNPs (72,33%; 6,33; 7,33 cm; 2,06 cm2; 5,83 g; 35,03 nmol/cm2) và đối

chứng (69,33%; 6,00; 6,66 cm; 1,94 cm2; 5,46 g; 33,53 nmol/cm2).

Bảng 3.11. Khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây dâu tây trong vỉ xốp sau 4 tuần nuôi trồng

Nano (mg/L) Tỷ lệ

Chiều

Diện

Khối

Chlorophyll

AgNP	s	(%)		(cm)	(cm2)	tươi (g)
0,0	0,0	69,33b	6,00b	6,66b	1,94b	5,46b	33,53b
0,5	-	72,33b	6,33b	7,33b	2,06b	5,83b	35,03b
-	1,4	86,00a	8,66a	11,33a	3,24a	8,86a	39,90a

FeNPs

sống

Số lá

cao cây

tích lá

lượng

(nmol/cm2)

Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức = 0,05 trong phép thử Duncan.

Các cây con này sau đó được chuyển qua chậu nhựa để tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển tiếp theo. Kết quả ghi nhận ở các chỉ tiêu theo dõi cho thấy sự sinh trưởng và phát triển của 1,4 mg/L FeNPs vẫn trội hơn so với 0,5 mg/L AgNPs và đối chứng. Sau 6 tuần trồng trong chậu nhựa, cây có nguồn gốc từ 1,4 mg/L FeNPs bắt đầu ra ngó tạo cây con F1. Trong khi đó, cây có nguồn gốc từ nồng độ 0,5 mg/L AgNPs quá trình này phải mất đến 7 tuần và 9 tuần đối với đối chứng. Sau 8 tuần nuôi trồng trong điều kiện vườn ươm, cây dâu tây có nguồn gốc từ 1,4 mg/L FeNPs đã ra hoa, đậu quả và từ cây con F1 bắt đầu sinh sản sinh dưỡng tạo cây con F2. Số cây ở 1,4 mg/L FeNPs tiếp tục sinh trưởng và phát triển ở những tuần tiếp theo và

trái có thể thu hoạch ở tuần thứ 10 trở đi. Trong khi đó, các cây ở 0,5 mg/L AgNPs đến tuần thứ 10 mới ghi nhận sự ra hoa, đậu trái, tạo ngó F2 và đối chứng bắt đầu có sự ra hoa, đậu trái. Trái chỉ bắt đầu được thu nhận ở nghiệm thức bổ sung 0,5 mg/L AgNPs từ tuần thứ 12 trở đi và đối chứng là từ tuần 14 trở đi. Sau 12 tuần nuôi trồng trong chậu nhựa, kết quả ghi nhận chiều cao cây (15,01%), tỷ lệ đậu trái (81,76%), số lượng ngó F1 (6,00), số lượng ngó F2 (3,00) diện tích lá (14,00 cm2), khối lượng tươi (39,86) ở môi trường thay thế Fe-EDTA bằng 1,4 mg/L FeNPs cao hơn so với môi trường bổ sung 0,5 mg/L AgNPs (11,40%; 76,66%; 3,00; 0,00; 8,22 cm2; 22,83

g) và đối chứng (10,30%; 50,00%; 2,00; 0,00; 7,33 cm2; 21,80 g).

Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây trong chậu nhựa sau 12 tuần nuôi trồng

Nano (mg/L) Chiều cao cây

Tỷ lệ đậu trái

Số lượng

Diện tích lá

Khối lượng

AgNPs FeNPs (cm)

(%)	ngó F1	ngó F2	(cm2)	tươi (g)
0,0	0,0	10,30b	50,00b	2,00b	0,00b	7,33b	21,80b
0,5	-	11,40b	76,66a	3,00b	0,00b	8,22b	22,83b
-	1,4	15,01a	81,76a	6,00a	3,00a	14,00a	39,86a

Ghi chú: *Những chữ cái khác nhau (a,b,c...) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức = 0,05 trong phép thử Duncan.