Thí Nghiệm Đánh Giá Sự Đối Kháng Lẫn Nhau Của Các Chủng Vktqh Lựa Chọn. (1)-

Hình 3.22. Thí nghiệm đánh giá sự đối kháng lẫn nhau của các chủng VKTQH lựa chọn. (1)- DQ41; (2)- DD4; (3),- FO2

3.4.2.2. Đánh giá hiệu quả tạo màng sinh học trên các loại giá thể

Trong nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn một số loại giá thể phù hợp cho mục đích xử lý ô nhiễm bao gồm: nhẹ, diện tích bề mặt lớn, dễ tìm kiếm, giá thành rẻ. Ba loại giá thể đã được lựa chọn, gồm: (1) giá thể có nguồn gốc tự nhiên (xơ dừa) và (2) giá thể có nguồn gốc nhân tạo (mút xốp, sỏi nhẹ). Trước khi sử dụng trong nghiên cứu, ba loại giá thể được xử lý sơ bộ để loại bỏ tạp chất và các loại vi sinh vật không mong muốn có mặt trong nguyên liệu.

Để cố định VK trên giá thể, tế bào của các chủng DD4, DQ41 và FO2 với tỷ lệ bằng nhau được nuôi trong môi trường DSMZ 27. Lấy 5 ml dịch huyền phù tế bào ở bước sóng OD600 nm, được rửa cùng với dung dịch đệm photphat và được tiếp tục nuôi trong môi trường 100 ml DSMZ 27 trong 72 giờ, nhiệt độ 30 °C để đạt được khoảng 2 × 109 CFU. Sau đó, dịch huyền phù tế bào được nuôi cấy trong 100 ml môi trường DSMZ 27 và 1,5 g xơ dừa, mút xốp, sỏi nhẹ chìm trong môi trường. Quá trình này được nuôi ở nhiệt độ 30 °C trong 120 giờ trong môi trường cố định để giúp màng sinh học vi khuẩn bám trên bề mặt của giá thể. Cứ sau 48 giờ, môi trường đã qua sử dụng được thay thế bằng môi trường mới. Các tế bào bám dính hoặc được sử dụng ngay lập tức hoặc được giữ ở 4 °C trong 3 tuần. Vì vậy, những giá thể màng sinh học này đã được sử dụng trong vòng 3 tuần. Tương tự, màng sinh

học đơn chủng và màng sinh học đa chủng được thực hiện không có giá thể với mật độ vi khuẩn ban đầu là 8 × 102 CFU / L

Số lượng VKTQH trong màng sinh học đơn và đa chủng có hoặc không có giá thể được xác định để đánh giá hiệu quả tạo màng sinh học (Hình 3.23).

Hình 3.23. Mật độ tế bào của chủng DD4, DQ41 và FO2 trong MSH sau 9 ngày nuôi cấy

Ở ngày 0, số lượng của mỗi chủng vi khuẩn ban đầu tương ứng với 8 × 102 (CFU m / L) (SD = 13). Sau 9 ngày nuôi cấy với nồng độ dầu diesel ban đầu là 17,2 g/L, số lượng tế bào của mỗi chủng là gần 7,93 đơn vị log. Số lượng tế bào của mỗi chủng VKTQH trong MSH đơn chủng/MSH đa chủng không giá thể và MSH đa chủng trên giá thể xơ dừa không thay đổi, trong khi số lượng VKTQH trong MSH gắn trên giá thể sỏi nhẹ và mút xốp giảm.

Quan sát dưới kính SEM màng sinh học cho thấy độ xốp của tất cả các giá thể phù hợp cho sự hấp phụ của các tế bào vi khuẩn vào giá thể (Hình 3.24). Trong đó, sỏi nhẹ có nhiều cấu trúc mút xốp, nơi vi khuẩn có thể xâm chiếm; xơ dừa có cấu trúc sợi hình thành bởi các sợi song song; mút xốp không xốp như các giá thể khác nhưng theo Alessandrello và cộng sự (2017), mút xốp là một vật liệu tiềm năng để gắn vi khuẩn và được áp dụng trong phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ [133]. Các đặc tính lý tưởng của giá thể đó là không độc, rẻ tiền và có độ xốp cao cũng như có cấu trúc dạng sợi để gắn kết các tế bào phát triển [150]. Các giá thể có thể thúc đẩy sự cố định của vi sinh vật bằng cách hỗ trợ khu vực sống cho vi sinh vật,

sử dụng các thành phần hydrocacbon trong dầu làm nguồn carbon và năng lượng cho sự phát triển, đồng thời cho phép khuếch tán oxy nhanh chóng như một chất nhận điện tử [151]. Sự hiện diện của các vi khuẩn cố định trên các giá thể này đã được khẳng định đề xuất trên.

Sỏi nhẹ

Xơ dừa

Mút xốp

Hình 3.24. Hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) của các giá thể trước và sau khi VKTQH bám dính (độ phóng đại 7000-1000 lần)

VKTQH được quan sát thấy có hình dạng que với kích thước khoảng 1 x 0,3 (nm), tạo cấu trúc màng sinh học bền vững. Độ dày của màng sinh học tạo thành

trên giá thể sỏi nhẹ, xơ dừa và mút xốp cao nhất được xác định tương ứng là 13, 20 và 12 nm. Theo công bố của Levison và cộng sự (1994), chất nền và oxy có thể dễ dàng khuếch tán cho các hoạt động trao đổi chất trong màng sinh học có độ dày từ 10–20 mm [152]. Hơn nữa, số lượng VKTQH được gắn trên xơ dừa cao hơn so với sỏi nhẹ và mút xốp (Hình 3.2). Như vậy có thể kết luận xơ dừa là giá thể phù hợp nhất cho VKTQH bám dính.

Cấu trúc giá thể cho phép tăng bề mặt tương tác giữa cơ chất, vi khuẩn và môi trường nước, dẫn đến tăng hiệu suất phân hủy. Một số nghiên cứu trước đây đã đưa ra giả thuyết về cơ chế hấp phụ và phân huỷ dầu diesel trên màng sinh học. Cụ thể: trong giai đoạn đầu tiên các giá thể hấp phụ nhanh dầu diesel và làm giảm đáng kể nồng độ dầu. Giai đoạn thứ hai là quy trình xử lý sinh học trong đó vi khuẩn sử dụng hydrocarbon dầu mỏ làm nguồn carbon để giảm các thành phần dầu trong nước. Cuối cùng, dầu diesel bị VK phân huỷ thành CO2 và H2O [153, 154].

3.4.2.3. Hiệu suất phân hủy dầu diesel của màng sinh học

Màng sinh học đơn chủng và màng sinh học đa chủng VKTQH hình thành trên các giá thể khác nhau hoặc không có giá thể được đánh giá về hiệu suất phân hủy dầu diesel. Đối chứng là mô hình thí nghiệm chỉ có giá thể, không có VKTQH. Dầu diesel được bổ sung vào thí nghiệm với nồng độ ban đầu 17,2 g/l. Hiệu quả phân hủy được đánh giá sau 14 ngày nuôi cấy qua phân tích trọng lượng dầu còn lại.

Kết quả phân tích (Hình 3.25a) cho thấy khi không có giá thể màng sinh học tạo ra bởi từng chủng DD4, DQ41 và FO2 đã phân hủy dầu diesel với hiệu suất lần lượt là 56, 60 và 58%, màng sinh học đa chủng đạt 78%.

Sự gia tăng số lượng tế bào VKTQH được quan sát rõ sau 5 ngày nuôi cấy, phù hợp với hiệu suất phân hủy tăng sau 5 ngày nuôi cấy. Sau 9 ngày, số lượng tế bào có xu hướng giảm, tương ứng với hiệu suất phân hủy đi xuống, nguyên nhân do lượng cơ chất đã cạn kiệt. Từ kết quả thu được, có thể suy ra rằng để sản xuất sinh khối, các tế bào đòi hỏi phải khai thác dầu diesel làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất.

a b c d Hình 3 25 Đồ thị biểu thị thời gian phân hủy dầu diesel và mật 3


(a)	(b)

(c)	(d)

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 144 trang tài liệu này.

Hình 3.25. Đồ thị biểu thị thời gian phân hủy dầu diesel và mật độ tế bào của chủng VKTQH trong màng sinh học đơn hoặc đa chủng không giá thể.

Chú thích: (a), DD4; (b), DQ41 (c), FO2 và (d), MSH đa chủng không gắn giá thể

Sau 14 ngày nuôi cấy với nồng độ ban đầu 17,2 g/l, hiệu suất phân hủy dầu diesel bởi màng sinh học đa chủng VKTQH trên giá thể (sỏi nhẹ, mút xốp và xơ dừa) (Hình 3.26) không khác biệt lớn. Ba loại giá thể sỏi nhẹ, mút xốp và xơ dừa hấp phụ một lượng nhỏ dầu diesel, tương ứng là 16, 12 và 15%. Trong khi đó, màng sinh học đa chủng được hình thành trên giá thể sỏi nhẹ, mút xốp và xơ dừa phân hủy dầu diesel ở mức cao lần lượt là 90, 91 và 95% (p <0,05).

Hình 3.26. Khả năng phân hủy dầu diesel và mật độ tế bào của chủng VKTQH DD4, DQ41 và FO2 trong MSH đa chủng trên giá thể.

(a), MSH trên sỏi nhẹ; (b), MSH trên xơ dừa; (c), MSH trên mút xốp

Kết quả (Hình 3.25 và Hình 3.26) chỉ ra rằng màng sinh học tạo thành bởi VKTQH trên giá thể có hiệu suất phân hủy dầu diesel > 90%, đặc biệt là màng sinh học trên xơ dừa 95% (p <0,05), cao hơn rất nhiều so với màng sinh học không tạo trên giá thể (56 – 78%).

Trong nghiên cứu của chúng tôi, thành phần chính của dầu diesel là n-alkane có số lượng carbon từ 8 đến 16. Do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu suất phân hủy các n-alkane khác nhau trong dầu diesel (đối chứng là giá thể xơ dừa không có VKTQH và màng sinh học đa chủng không gắn giá thể).

Hiệu suất phân hủy các thành phần n-alkane trong dầu diesel bởi màng sinh học đa chủng VKTQH sau 14 ngày được thể hiện trên Hình 3.27.

Hình 3.27. Hiệu suất phân hủy thành phần n-alkane (từ C8 đến C16) có trong dầu diesel bởi màng sinh học đa chủng VKTQH trên các giá thể sau 14 ngày nuôi cấy (Đối chứng: xơ dừa không có VKTQH và MSH đa chủng không giá thể)

Các kết quả thu được cho thấy giá thể chỉ có thể hấp phụ một phần nhỏ n- alkane, hiệu suất phân hủy bởi màng sinh học trên giá thể cao hơn hẳn so với màng sinh học đa chủng không gắn giá thể, cụ thể: hơn 77% thành phần hydrocarbon đã bị phân hủy bởi màng sinh học đa chủng trên ba loại giá thể, cao nhất là hiệu suất

phân hủy n-alkane của màng sinh học trên xơ dừa dao động từ 80 đến 94%, trong khi màng sinh học trên sỏi nhẹ và mút xốp hiệu suất phân hủy thấp hơn và không có sự khác biệt lớn (p> 0,05). Từ các kết quả thu được cho thấy xơ dừa là giá thể tốt nhất để loại bỏ dầu diesel.

Những kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây chứng minh rằng vi khuẩn cố định trên giá thể tăng cường loại bỏ dầu diesel [122, 153, 154]. Sự hình thành màng sinh học trên giá thể có thể bảo vệ các tế bào chống lại các điều kiện môi trường khắc nghiệt và các chất ô nhiễm độc hại [107, 122].

Chen và cộng sự (2020) khi nghiên cứu khả năng phân huỷ các n-alkane (C22 – C30) khác nhau trong điều kiện nuối cấy kị khí với hàm lượng ban đầu 200mg, thấy rằng: sau 322 ngày hàm hượng các n-alkane bị phân huỷ khoảng 31,3

– 56,8 % (nhóm VK phân huỷ chủ yếu là Methanothermobacter), hàm hượng các n- alkane bị phân huỷ gần như hoàn toàn (97,3 – 99,7 %) sau 736 ngày (nhóm VK phân huỷ chủ yếu là Thermoplasmatales) [155].

Sử dụng vi khuẩn hiếu khí và nấm men cố định trên các giá thể nhằm tăng hiệu quả phân hủy hydrocarbon trong dầu diesel đã được công bố trong một số nghiên cứu trước đây. Cụ thể: Hiệu suất của quá trình phân hủy dầu diesel do Candida tropicalis cố định trên các nguyên liệu sinh học (cám lúa mì, mùn cưa, bột vỏ lạc) đã được tác giả Chan và Das khảo sát năm 2011. Các loài nấm men được cố định trong cám lúa mì cho thấy hiệu quả phân hủy cao hơn dầu diesel cao hơn (98%) so với nuôi cấy tế bào tự do (80%) trong thời gian 7 ngày [156]. Liu và cộng sự (2015) công bố 78% hàm lượng dầu diesel được loại bỏ (nồng độ ban đầu là 2342 ppm) khỏi nước biển nhân tạo sau 16 ngày nuôi lắc trong điều kiện tối ưu bằng cách bao gói calcium alginate ra bên ngoài các tế bào [157]. Simons và cộng sự đã sử dụng tổ hợp vi khuẩn được huy động trên các giá thể khác nhau (alginate hoặc vỏ ốc). Phân tích GCMS đã chứng minh mức độ phân hủy hydrocarbon phụ thuộc vào giá thể. Việc gia tăng sạn vỏ ốc, các chất dinh dưỡng và các chất phân hủy hydrocarbon ngoại sinh dẫn đến phân hủy tới 75 ± 14% hydrocarbon >C32 sau 12 tuần sovới giá thể alginate 20 ± 14% [158]. Mới đây, nghiên cứu của Zhang và cộng sự đã khảo sát sự cố định của vi khuẩn với hai loại vật liệu tảo, bột tảo Enteromorpha và bột tảo bẹ. Bacillus sp. E3 được cố định trên giá thể bột tảo