Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp

Lớp 2 và 3: Mycolate arabino galactane

Lớp 4: glycolipide với 3 chất: sáp D, yếu tố thừng và micoside

Vỏ của vi khuẩn lao chi phối 3 đặc tính của vi khuẩn lao: khả năng gây bệnh, tạo ra tính mẫn cảm, tạo ra tính kháng cồn, kháng toan. Cấu trúc vỏ tế bào của vi khuẩn lao tạo ra các tính chất nhuộm. Khi nhuộm Gram,vi khuẩn bắt mầu của vi khuẩn Gram dương. Cấu trúc mycolic acid tạo ra khả năng kháng lại các chất tẩy aniline là cồn acid.

Tính chất nuôi cấy và khả năng đề kháng:

Vi khuẩn lao hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích nghi 37oC, pH thích nghi 6,7 - 7.Vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường đặc Loeweinstein - Jensen, Ogawa Mark, môi trường lỏng Sauton. Ở môi trường Loeweinstein- Jensen khuẩn lạc xuất hiện khoảng sau một tháng, khô nhăn nheo giống như hoa súp lơ, màu trắng ngà. Ở môi trường lỏng Sauton vi khuẩn mọc nhiều ở bề mặt chất lỏng thành những mảng nhăn nheo, khô và dính vào thành ống.

Vi khuẩn lao phát triển chậm, thời gian nhân đôi là 12-24 giờ trong khi của E.coli là 20 phút. Những chủng độc lực tạo thành những khuẩn lạc R. Những chủng độc lực kém tạo thành những khuẩn lạc ít nhăn nheo hơn và phát triển ít có trật tự hơn.

Khả năng gây bệnh

Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể.

Sự bền vững của vi khuẩn lao với môi trường bên ngoài [02].

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 126 trang tài liệu này.

Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại 3-4 tháng. Trong phòng thí nghiệm người ta có thể bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm. Dưới ánh nắng mặt trời, vi khuẩn bị chết sau 1,5 giờ. Khi chiếu tia cực tím chúng chỉ tồn tại được 2-3 phút. Ở 420C vi khuẩn ngừng phát triển và chết sau 10 phút ở 800C.

Đờm của bệnh nhân lao trong phòng tối, ẩm sau 3 tháng vi khuẩn vẫn tồn tại và giữ được độc lực; nhưng khi đun sôi đờm trong 5 phút chúng đã bị chết. Với cồn 900 vi khuẩn lao tồn tại được 3 phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chết ngay sau 1 phút.

Đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn lao[25], [70].

Vi khuẩn lao trong quá trình sinh sản có thể xuất hiện những loại đột biến kháng thuốc. Những vi khuẩn lao kháng thuốc này là loại kháng thuốc trong nhiễm sắc thể. Cơ chế là do chọn lọc tự nhiên, có thể từ một quần thể vi khuẩn đa số chịu thuốc trở thành một quần thể vi khuẩn kháng thuốc hoàn toàn kháng một hoặc nhiều loại thuốc. Các chủng vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc với một loại thuốc chống lao nào được gọi là “Chủng hoang dại”. Một chủng kháng thuốc tự nhiên là một chủng hoang dại kháng với một thuốc mà vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc. Như vậy, cả vi khuẩn kháng thuốc tự nhiên và bệnh nhân có vi khuẩn này đều chưa bao giờ tiếp xúc với thuốc chống lao. Kháng thuốc tự nhiên xảy ra ở những nơi thuốc chống lao chưa bao giờ được sử dụng. Nguyên nhân của kháng thuốc tự nhiên là do đột biến gien. Tần xuất những đột biến kháng thuốc tự nhiên phụ thuộc vào nguồn gốc của chủng, loại thuốc, nồng độ thuốc và tổng số vi khuẩn. Số lượng vi khuẩn giảm sẽ giảm đột biến kháng thuốc.

1.2.2. Một số phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao.

1.2.2.1. Các phương pháp cổ điển

Soi trực tiếp

Nhuộm Ziehl – Neelsen và soi kính cho đến nay vẫn là một phương pháp đơn giản, rẻ tiền và cho kết quả nhanh. Tuy nhiên, soi kính chỉ cho phép phát hiện được trực khuẩn lao ở nồng độ 105 trực khuẩn/ml trở lên, vì vậy độ nhậy của phương pháp thấp, từ 40% - 60% (bệnh phẩm của bệnh nhân lao

người lớn) và chỉ đạt từ 10% - 20% (bệnh phẩm của bệnh nhân lao ngoài phổi). [25], [69], [83].

Soi kính không cho phép định danh vi khuẩn lao ở mức độ loài, chỉ xác định được hình thể, không phân biệt được vi khuẩn sống hay chết và không có hiệu quả trong việc xác định vi khuẩn lao kháng thuốc. Hơn nữa, kết quả soi kính cần phải được khẳng định bằng nuôi cấy và các thử nghiệm chẩn đoán xác định khi có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn lao thuộc nhóm không điển hình hoặc khi cần xác định độ nhạy cảm đối với kháng sinh điều trị [83], [97].

Tuy nhiên soi kính là phương pháp duy nhất để xác định nguồn lây chính: những người có ho khạc ra nhiều vi khuẩn lao có kết quả soi AFB(+) Nuôi cấy.

Là những phương pháp phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lao trên môi trường nuôi cấy in vitro. Hiện nay có rất nhiều loại môi trường để nuôi cấy vi khuẩn lao, được chia làm hai loại: môi trường đặc và môi trường lỏng. Cho đến nay, nuôi cấy trên môi trường đặc vẫn là một phương pháp kinh điển được sử dụng rộng rãi trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng [119]. Môi trường rắn có thể là môi trường trứng (Egg-Base Medium) Loeweinstein- Jensen, American Trudeau Society (AST) hoặc môi trường agar (Agar-Base Medium) như Middlebrook 7H10 và Middlebrook 7H11.

1.2.2.2. Một số kỹ thuật hiện đại.

Sử dụng Hệ Bactec

Nguyên lý: Người ta gắn cacbon phóng xạ vào acid palmitric và acid formic trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn lao. Khi vi khuẩn chuyển hoá sẽ lấy các acid béo này và giải phóng ra CO2 (chứa cacbon phóng xạ) được đo bằng máy Bactec 460 30, [02].

Hệ thống đo phóng xạ BATEC ra đời cho phép phát hiện sớm quá trình mọc của vi khuẩn trên môi trường bằng việc tự động phát hiện lượng 14CO2 do vi khuẩn giải phóng ra trong quá trình trao đổi chất và carboxi hoá

cơ chất có đánh dấu phóng xạ 14C. Kỹ thuật này có ưu điểm là cho kết quả

nhanh (5 - 7 ngày) và cũng phát hiện được chủng vi khuẩn kháng thuốc. 30, [02].

Phương pháp MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tubes)

Người ta sử dụng biện pháp đặc biệt để kích thích vi khuẩn lao sinh sản nhanh, vi khuẩn lao khi phát triển sẽ sử dụng oxy (O2) và thải CO2. Bằng bộ phận nhận cảm có phát quang có thể nhận biết được CO2 (chuyển môi trường từ màu xanh lục sang màu vàng). Phương pháp này cũng cho kết quả nhanh trong vòng từ 3-10 ngày [02].

Nguyên lý: Một phức hợp huỳnh quang được gắn ở đáy týp nuôi cấy. Phức hợp này nhậy cảm với sự có mặt của O2 hoà tan trong môi trường. Đầu tiên, do lượng O2 hoà tan lớn nên kìm chế sự phát quang từ phức hợp, khi đó chỉ một lượng nhỏ ánh sáng huỳnh quang có thể được phát hiện. Sau đó, khi có mặt vi khuẩn trong môi trường, do hoạt động của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất, đã tiêu thụ bớt O2 dẫn đến việc phát sáng của chất huỳnh quang, phát hiện được ở bước sóng 365 nm. Sự phát triển của vi khuẩn cũng có thể được phát hiện bởi sự xuất hiện độ đục không đồng nhất hoặc những hạt nhỏ hay mảnh vụn trong môi trường nuôi cấy 25,20.

Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR)

Một phát minh quan trọng của sinh học phân tử trong những năm gần đây là kỹ thuật khuyếch đại acid nucleic (ADN và ARN). Kỹ thuật hiện nay được sử dụng ở nhiều nước là phản ứng chuỗi polymeraza (PCR). Ra đời vào năm 1986, kỹ thuật PCR đã nhanh chóng cung cấp những ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực công nghệ sinh, y học [81]. Việc áp dụng PCR trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, đặc biệt là bệnh lao đã cung cấp một công cụ

đầy triển vọng, đáp ứng với nhu cầu cấp thiết, đã cho ra đời một phương pháp chẩn đoán nhanh, hiệu quả và an toàn khi mà đa số các phương pháp chẩn đoán bệnh lao cổ điển đều còn nhiều bất cập. Kỹ thuật PCR cho phép xác định vi khuẩn lao trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên gienom của vi khuẩn [81], [84], [86].

Cũng giống như phương pháp soi kính, phương pháp PCR có thể cho kết quả nhanh trong vòng 1 ngày nhưng độ nhạy và độ đặc hiệu lại cao hơn nhiều. Trong một số nghiên cứu khi nuôi cấy được coi là tiêu chuẩn vàng, độ nhạy của PCR đạt tới 71% đến 91%, độ đặc hiệu từ 95% - 100% [83].

Cho tới nay hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới khi sử dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán bệnh lao đều phát hiện các thường quy riêng. Đoạn khuôn mẫu được sử dụng nhiều nhất là đoạn trình tự acid nucleic nằm trên gien nhảy IS 6110. IS 6110 chỉ có mặt trong nhóm Mycobacterium tuberculosis và các Mycobacteria khác thuộc nhóm M.complex và thường có độ lặp lại cao trong hệ gien của vi khuẩn lao do vậy là một trình tự lý tưởng để đóng vai trò đoạn ADN đích. Sự phân biệt giữa M. tuberculosis và M. Bovis cũng có thể bằng đoạn IS 6110 vì M. Bovis chỉ có một đoạn IS 6110 [123].

Người ta cũng sử dụng nhiều trình tự khác nhau như IS 986, P36 (đây là các gien nhảy có đặc điểm tương tự như IS 6110), rARN 16S, các gien mã hoá cho protein 65 kD và 38 Kd [82].

Ngoài ra sự khác nhau về trình tự acid nucleic đích, phương pháp tách chiết ADN, số chu kỳ nhân gien và các phương pháp phát hiện sản phẩm sao chép của PCR cũng khác nhau ở mỗi phòng thí nghiệm. Kỹ thuật điện di trên gel agarose hoặc lai ghép với các đoạn mồi đặc hiệu có đánh dấu phóng xạ là các kỹ thuật phổ biến để phát hiện sản phẩm sao chép, tuy nhiên một số tác giả cũng đã sử dụng các đoạn mồi đánh dấu với chất không phóng xạ [82].

Bên cạnh những ưu điểm, kỹ thuật PCR cũng có những mặt hạn chế:

- Do phân tử ADN có thể được phát hiện ngay cả khi vi khuẩn đã bị chết nên kỹ thuật PCR không cho biết vi khuẩn lao còn sống hay đã chết mà điều này rất cần thiết cho việc theo dõi kết quả điều trị.

- Có thể có dương tính giả, âm tính giả.

Chống nhiễm:

Do PCR có độ nhạy cao, khả năng dương tính giả có thể xảy ra nếu trong quá trình thực hiện, bệnh phẩm hoặc vật liệu sử dụng bị nhiễm một lượng nhỏ ADN vi khuẩn lao có trong môi trường, hoặc từ các bệnh phẩm có chứa vi khuẩn, hoặc bị nhiễm các đoạn ADN là sản phẩm sao chép của những lần chạy PCR trước. Sản phẩm sao chép của PCR có thể trở thành một mối đe doạ nếu không có biện pháp xử lý hiệu quả. Một ống phản ứng sau 40 chu kỳ nhân gien có thể chứa tới 1012 bản sao, và chỉ cần một bản sao lọt vào ống

mới cũng đủ để phản ứng cho kết quả dương tính giả đối với ống đó 84.

Tuy nhiên ngày nay người ta đã có thể loại bỏ khả năng dương tính giả do nhiễm các đoạn ADN bản sao bằng việc sử dụng ezyme uracil DNA glycosylase (UNG) kết hợp với dUTP thay vì dTTP trong hỗn dịch phản ứng. UNG được hoạt hoá ở 400C trước khi phản ứng xảy ra phá huỷ toàn bộ các bản sao nếu do sơ xuất bị nhiễm vào hỗn dịch phản ứng. UNG phá huỷ các bản sao bằng cách cắt tại các vị trí Uraxin trên trình tự phân tử của nó vì vậy chỉ loại bỏ các bản sao do chúng có chứa Uraxin trong khi trình tự ADN đích

tách chiết từ vi khuẩn thì vẫn được bảo vệ. UNG sẽ bị bất hoạt ở nhiệt độ cao hơn khi quá trình nhân gien xảy ra vì vậy không ảnh hưởng đến sản phẩm của phản ứng 87.

Ngoài ra để chống nhiễm chéo, các nguyên tắc ngặt nghèo về vô trùng phải được tuân thủ trong suốt quá trình thực hiện. Phòng thí nghiệm phải được sắp xếp sao cho các bước thực hiện kỹ thuật được tiến hành trong các khu vực riêng biệt, dụng cụ, hoá chất phải tuyệt đối vô khuẩn.

Chất ức chế PCR:

Bên cạnh dương tính giả, PCR cũng có thể cho âm tính giả khi có sự can thiệp của các chất ức chế hoặc kìm hãm phản ứng. Các chất này thường là một trong những thành phần có trong bệnh phẩm có khả năng ức chế hoặc làm giảm hoạt tính enzyme ADN polymeraza, khiến cho phản ứng khuyếch đại gien xảy ra hoặc không xảy ra 82.

Tỷ lệ chất ức chế phản ứng PCR trong một số nghiên cứu dao động từ 3% đến 52% đối với bệnh phẩm đường hô hấp 86. Người ta đã tìm cách phát hiện sự có mặt của chất ức chế bằng cách khuyếch đại ADN tách chiết từ mỗi bệnh phẩm trong 2 ống phản ứng trong đó một lượng nhỏ ADN của vi khuẩn lao được thêm vào một ống. Kết quả âm tính của ống này sẽ cho phép khẳng định sự có mặt của chất ức chế trong bệnh phẩm.

Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi số ống phản ứng tăng lên đáng kể khi làm với một số lượng mẫu lớn. Để khắc phục người ta sử dụng ADN của

M. smegmatis thay thế cho ADN của M. tuberculosis. Do trình tự nhận biết trên IS 6110 của M. smegmatis nhưng bị sửa đổi bằng cách thêm vào 56 đôi bazơ. Sản phẩm PCR được nhân từ trình tự trên M. smegmatis sẽ được phân biệt với sản phẩm nhân từ trình tự trên vi khuẩn lao nhờ sự khác nhau về độ dài phân tử của chúng.

M. smegmatis có thể được sử dụng như một nội chứng ngay trong bệnh phẩm. Một lượng xác định vi khuẩn M. smegmatis được cho vào trong bệnh phẩm trước khi tiến hành xử lý mẫu và tách chiết ADN sẽ kiểm tra được hiệu quả tách chiết ADN đồng thời đánh giá được sự có mặt của chất ức chế nếu có trong bệnh phẩm và định lượng một cách tương đối vi khuẩn vi khuẩn lao có trong bệnh phẩm 82.

Các kỹ thuật tách chiết ADN từ bệnh phẩm ít nhiều đều đã cố gắng để loại bỏ các chất ức chế. Tuy vậy khi so sánh phương pháp của Boom và cộng sự với

phương pháp truyền thống dùng phenol để xử lý các bệnh phẩm có chất ức chế PCR, kết quả nghiên cứu của A.Kolk cho thấy phương pháp của Boom sử dụng đơn giản và hiệu quả hơn do cùng một lúc vừa tách chiết, vừa tinh sạch được ADN lại không sử dụng phenol 82.

Phát hiện vi khuẩn lao sống bằng phương pháp RT – PCR, ELISA

Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta đã chứng minh được rằng sự có mặt của ARN chính là một dấu hiệu để đánh giá mức độ sống của vi khuẩn. Chỉ những vi khuẩn còn sống mới được phát hiện bằng cách sử dụng mARN làm khuôn trong phản ứng RT – PCR (Reverse transcriptase PCR). Hầu hết các phân tử mARN đều rất dễ bị phân huỷ và có vòng đời ngắn. Do vậy sự có mặt của mARN thường biểu thị quá trình sao chép liên tục của gien. Patel và các cộng sự đã sử dụng phản ứng RT – PCR để xác định khả năng sống sót của M. leprae bị giết bằng nhiệt và ông đã phát hiện dnaK mARN chỉ tồn tại trong các tế bào sống. Gần đây, Hellyer và các cộng sự đã nhận thấy rằng lượng fobB ( 85B, entigien) mARN của vi khuẩn lao giảm từ <4 và 0,01% sau 24 giờ điều trị Isoniazid và Rifampixin. Một nghiên cứu mới đây cũng chỉ ra rằng mARN chỉ tồn tại trong vi khuẩn lao sống. Tương tự như vậy, ở các vi khuẩn khác, mARN không phát hiện thấy trong các tế bào bị giết bằng nhiệt hoặc bằng các điều trị hoá học. Do có vòng đời ngắn, nên mARN bị phân huỷ rất nhanh trong các tế bào chết, vì vậy, nó được coi là một dấu hiệu lý tưởng cho việc phát hiện vi khuẩn sống.

1.2.3. Phát hiện vi khuẩn lao trong môi trường

Sự lây truyền lao trong các khu vực đặc biệt như nhà dưỡng lão, nhà tù, trung tâm cai nghiện, bệnh viện được phát tán rất nhanh. Khả năng nhiễm lao sau khi hít phải những giọt khí dung chứa vi khuẩn lao có kích thước nhỏ hơn 5 µm do bệnh nhân lao giải phóng ra không khí trong phòng khi ho hoặc nói chuyện [35]. Vì vậy việc kiểm soát không khí trong các khu vực kín có bệnh