Tính kháng thuốc oseltamivir của virut cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1. Các phân đoạn gen của vi rút cúm A 6

3.1. Phân bố theo năm các phân típ virut cúm A sử dụng trong nghiên cứu . 53

3.2. Giá trị trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu

và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn 56

3.3. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và

2009 ..................................................................................................... 60

3.4. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir năm

2009 và 2011 61

3.5. Giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 từ năm 2003 đến 2012 62

3.6. Giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 năm 2005 và 2008 62

3.7. Kết quả phân loại mức độ giảm độ nhạy của vi rút cúm A với oseltamivir 64

3.8. Mức độ giảm nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir và các điểm

đột biến 70

3.9. Tỉ lệ kháng oseltamivir của các chủng vi rút cúm A trong nghiên cứu

dựa trên hai phương pháp (ức chế neuraminidase và giải trình tự gen).. 71

DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình Tên hình Trang

1.1. Cấu trúc vi rút cúm 4

1.2. Hình ảnh vi rút cúm 4

1.3. Sự tham gia của các polymerase vào quá trình sao mã của vi rút cúm ... 10 1.4. Cấu trúc ribonucleoprotein của vi rút cúm 10

1.5. Cơ chế nhân lên của vi rút và cơ chế tác dụng của thuốc kháng vi rút ... 12

1.6. Cấu trúc và cơ chế tác dụng của amantadine và rimantadine 21

1.7. Cấu trúc của oseltamivir và zanamivir 22

1.8. Cơ chế hoạt động của neuraminidase và chất ức chế neuraminidase

trong quá trình giải phóng vi-rút ra khỏi tế bào 23

2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen 50

3.1. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H1N1 66

3.2. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm

A/H1N1pdm09 67

3.3. Đột biến tại vị trí 117 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 68

3.4. Đột biến tại vị trí 275 trên protein NA của các chủng cúm A/H5N1 69

3.5. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 74

3.6. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA các chủng cúm A/H1N1 –

nhóm 2, 2001-2009 75

3.7. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1, 2001-2009 76

3.8. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa NA các chủng cúm A/H1N1- nhóm

2, 2001-2009.......................................................................................... 77

3.9. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H1N1pdm09 79

3.10. Cây gia hệ gen NA các chủng cúm A/H1N1pdm09 80

3.11. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 83

3.12. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 1 84

3.13. Cây gia hệ gen HA các chủng cúm A/H5N1 clade 2.3.4 84

Sơ đồ

Tên sơ đồ	Trang
2.1. Quá trình phân	lập vi rút cúm .........................................	....................... 43
2.2. Quá trình xác đị	nh giá trị ức chế 50% của oseltamivir với vi rút cúm ... 45

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 147 trang tài liệu này.

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.1. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 55

3.2. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên

cứu 57

3.3. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu 58

3.4. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên

cứu 58

3.5. Độ tập trung của các giá trị IC50 của các chủng H5N1 trong nghiên

cứu 59

4.1. Sự lưu hành vi rút cúm tại Việt Nam 2006 – 2012 86

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh truyền nhiễm trong thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI vẫn đang là một thách thức lớn với các nhà khoa học trong ngành y học dự phòng ở Việt Nam. Nếu như trước đây, bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủ yếu từ vi khuẩn thì hiện nay căn nguyên vi rút lại là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm, đe dọa tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người. Các vụ dịch điển hình xảy ra gần đây như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Bệnh cúm tại Việt Nam, theo thống kê của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương trong quá trình giám sát các ca nhiễm cúm phối hợp với trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US-CDC), số người mắc cúm có xu hướng tăng lên từ 19,1% năm 2007, lên 21% năm 2008, 26,1% năm 2009 (Hệ thống giám sát cúm Quốc gia-NISS), đặc biệt đã có những trường hợp tử vong do nhiễm cúm gia cầm có độc lực cao.

Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Tuy nhiên, văc xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm. Hơn nữa, muốn đạt hiệu quả cao, chủng cúm trong thành phần văc xin phải có sự tương đồng kháng nguyên với chủng cúm lưu hành. Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch khi tiêm văc xin cúm còn phụ thuộc vào cơ địa của từng cá thể và loại văc xin sử dụng (văc xin cúm bất hoạt truyền thống, văc xin cúm bán phần (split vaccine)…). Do vậy, hiện tại sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir...) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm, đặc biệt là vi rút cúm A/H5N1. Tuy nhiên, sự tương tác của thuốc với vi rút có thể gây ra thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút mà một trong những hệ quả là xuất hiện vi rút kháng thuốc ở thế hệ sau. Hiện tượng kháng thuốc có thể ảnh hưởng đến quá trình điều trị của bệnh nhân: thời gian điều trị kéo dài, khả năng hồi phục sau điều trị chậm và tăng khả năng lây truyền chủng vi rút cúm kháng thuốc ra cộng đồng, làm tăng thêm gánh nặng bệnh tật cho bản thân bệnh nhân và xã hội [28, 81, 90, 121].

Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc, mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan

truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Đặc tính kháng thuốc cũng như mức độ tiến hoá của vi rút đã được tiến hành tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) trên thế giới như Mỹ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan.... Các nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện, giám sát và theo dõi các trường hợp kháng thuốc đơn lẻ hoặc theo nhóm, tìm hiểu các đột biến trên gen có liên quan đến khả năng kháng thuốc của vi rút cúm trên người và trên gia cầm [8,11,12,26,51]. Số liệu từ các nước Châu Âu, Úc, Mỹ và các nước khu vực Đông Nam Á cho thấy vi rút A/H1N1 lưu hành trước năm 2007 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), từ 2007 đến 2009 tỉ lệ kháng tăng dần (23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm 2009) [27, 66, 110]; các vi rút A/H3N2 được xác định kháng hoàn toàn (100%) với amantadine.

Tại Việt Nam, quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại học Oxford thuộc bệnh viện Bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh [18,36,37]. Tại phòng thí nghiệm Cúm - viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, những trường hợp nhiễm vi rút cúm có mang gen kháng thuốc đơn lẻ đã được xác định từ những năm 2001 [56, 58, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ hoàn thành ở mức độ ca bệnh riêng lẻ hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, chưa có nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá theo thời gian của chủng vi rút cúm A mang gen kháng thuốc.

Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu:

- Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam.

- Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50).

- Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012.

1.1. Vi rút cúm A

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN

1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A Cấu tạo chung

Hình 1.1. Cấu trúc vi rút cúm Nguồn: http://viralzone.expasy.org/

màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipit kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ. Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH trong endosome thay đổi, có vai trò quan trọng trong việc hình thành hạt vi rút mới. Trên phần vỏ có 2 loại

Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae gồm 3 típ A, B và C, trong đó típ A và B thường gây thành dịch, típ C gây bệnh nhẹ và không lan thành dịch. Hệ gen của vi rút cúm A là Axit Ribonucleic (RNA) đơn âm, chia

8 phân đoạn mã hoá cho 11 protein. Về mặt cấu trúc, nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền (M1), phía ngoài

Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm Nguồn: www.nature.com

glycoprotein xuyên màng là heamagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Heamagglutinin có cấu trúc hình trụ, được cấu tạo bởi hai phân tử riêng biệt HA1 và HA2 nối với nhau bằng cầu disulphua, các phân tử trên HA gắn vào màng lipid bằng đầu kỵ nước. Glycoprotein quan trọng thứ hai trên bề mặt vi rút cúm là neuraminidase (NA). Cấu trúc NA có dạng hình nấm, các phân tử NA ở phần thân gắn với lớp màng qua các đầu kỵ nước. Phần lõi của vi rút bao gồm các phức hợp

ribonucleoprotein: các polymerase protein PB1 (polymerase basic 1), PB2 (polymerase basic 2) và PA (polymerase acidic); NP (nucleoprotein). Nucleoprotein gắn với các đoạn RNA của vi rút tạo thành nucleocapsid. Tồn tại trong thành phần của vi rút cúm còn có các RNA-RNA polymerase PB1, PB2, PA và các protein không cấu trúc NS (non structure).

Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A

Hệ gen của vi rút cúm A

Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần (Bảng 1). Đoạn RNA 1, 3, 4, 5 và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA. Mỗi phân đoạn 2, 7 và 8 mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1-M2 và NS1- NS2. Tại hai đầu mỗi phân đoạn gen có trình tự nucleotide bảo tồn gồm 13 nucleotide ở đầu 5' (5'-AGUAGAAACAAGG) và 12 nucleotide ở đầu 3' (3'UCGUUUUCGUCC), trừ phân đoạn gen 1, 2, 3 và 7 nucleotide thứ 4 C thay cho U [47]. Trình tự nucleotide này đặc trưng riêng cho vi rút cúm mà không tồn tại ở các vi rút các, có ý nghĩa lớn trong việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích trình tự gen của vi rút.

Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút

Heamagglutinin (HA): Heamagglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa bởi đoạn RNA số 4, có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Protein HA được tổng hợp ở dạng tiền thân là một chuỗi polypeptide HA0. Dưới điều kiện pH axit và các enzyme phân tách protein dạng trypsin và furin, HA0 phân tách ra hai phần: HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu nối di-sulphua [19]. Phần đầu chỏm của HA1 tại các vị trí xác định (106, 203, 222) có khả năng gắn với thụ thể axit sialic trên màng tế bào cảm nhiễm.