Các Dòng Hoa Lay Ơn Triển Vọng Được Trồng Tại Một Số Địa Phương (Vụ

Gia Lâm - Hà Nội

An Dương - Hải Phòng

Dĩnh Trì – Bắc Giang

Có thể bạn quan tâm!

Hình 4.16. Các dòng hoa lay ơn triển vọng được trồng tại một số địa phương (vụ Đông Xuân 2019-2020)

Chiều dài cành hoa của tất cả các dòng/giống trồng thí nghiệm đều lớn, trong đó dòng lai C6 có giá trị này tương đương với giống đối chứng ở cả 3 địa phương 129,7 - 132,7 cm. Tiếp theo là dòng lai I9 với chiều dài cành hoa từ 138,7 - 139,1cm. Chiều dài cành hoa lớn nhất được ghi nhận ở dòng lai J11 dao động từ 155,3 - 156,9 cm.

Cả 3 dòng lai đều có số lượng hoa/cành lớn hơn so với giống đối chứng, số lượng hoa/cành của các dòng lai từ 15 - 16 hoa.

Đường kính hoa của dòng lai C6 có giá trị tương đương với giống đối chứng ở cả 3 địa điểm trồng. Tiếp theo là 2 dòng lai I9 và J11 với đường kính hoa lớn từ 11,2 - 11,6 cm.

Tỷ lệ cành thu hoạch của các dòng lai đều cao hơn đối chứng và đạt trên 90%, trong khi đó giống đối chứng đạt từ 81 - 82,98%, so với đối chứng thì tỷ lệ thu hoạch của các dòng lai cao hơn từ 11 - 15%. Tương tự, tỷ lệ cành hoa loại I đạt cao ở các dòng lai mới từ 81,4 - 89,8%, tăng hơn so với đối chứng từ 14 - 21%.

Tóm lại: Các dòng lai lay ơn C6, I9, J11 được trồng thử nghiệm tại Hà Nội, Hải Phòng, Bắc Giang đã cho thấy những dòng này vẫn giữ được đặc tính sinh trưởng và chất lượng hoa ưu việt như nơi đánh giá ban đầu. Năng suất hoa của các giống đạt cao hơn giống đối chứng từ 11 - 15%.

4.3. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHẰM TĂNG HIỆU QUẢ NHÂN GIỐNG CỦA DÕNG LAI LAY ƠN J11 MỚI TẠO RA

4.3.1. Xác định hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho mẫu cấy

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, mẫu cấy vô trùng là điều kiện bắt buộc, quyết định thành công của thí nghiệm. Việc khử trùng phải đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp, đồng thời tỷ lệ mẫu tái sinh cao, mô tồn tại được và phát triển tốt. Hầu hết các nghiên cứu nhân giống in vitro lay ơn trên thế giới, hóa chất khử trùng được lựa chọn là HgCl2 0,08 - 0,1% trong thời gian 10 phút (Priyakumari & Sheela, 2005; Kabir & cs., 2014; Kumar & cs., 2018; Devi & cs., 2019) hiệu quả mẫu sạch đạt cao, tuy nhiên loại hóa chất này không an toàn cho người và môi trường. Ở thí nghiệm này, các loại hóa chất được lựa chọn là H2O2, Javen và NADCC là những chất khử trùng có mức độ an toàn cao. Kết quả thí nghiệm thu được qua bảng 4.43.

Tỷ lệ mẫu bị nhiễm ở tất cả các công thức tương đối thấp từ 6,67 - 23,33%. Sử dụng hoạt chất NADCC 1% có tỷ lệ mẫu bị nhiễm ở mức thấp nhất, tiếp đến là sử dụng H2O2 10% khử trung kép trong thời gian 15 phút.

Đối với cùng một hoạt chất khử trùng H2O2 10%, khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu nhiễm và tỷ lệ mẫu hóa nâu giảm xuống đáng kể. Cụ thể tỷ lệ hóa nâu ở CT2 chiếm 33,33%, trong khi đó CT1 và CT3 chỉ có 20%.

Bảng 4.36. Ảnh hưởng của hóa chất khử trùng mẫu cấy đến khả năng tái sinh chồi của dòng lai J11 (sau 4 tuần nuôi cấy)

CTTN

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu hóa nâu (%)	Tỷ lệ mẫu không phản ứng (%)	Tỷ lệ mẫu tái sinh (%)
CT1	10,00	20,00	6,67	63,33
CT2	23,33	33,33	10,00	33,33
CT3	16,67	20,00	16,67	46,67
CT4	13,33	10,00	26,67	50,00
CT5	6,67	13,33	3,33	76,67

Ghi chú: Môi trường nền MS + 3% Sucrose + 1 mg/l BAP. CT1: H2O2 10% lần 1 trong 10 phút, lần 2 trong 5 phút, CT2: H2O2 10% trong thời gian 10 phút, CT3: H2O2 10% trong thời gian 15 phút, CT4: Javen 5,7% trong thời gian 15 phút, CT5: NaDCC 1% trong thời gian 15 phút

Đối với CT1 và CT3 ở cùng một thời gian xử lý 15 phút, hiệu quả làm sạch mẫu của CT1 (khử trùng kép) tốt hơn với tỷ lệ mẫu không phản ứng thấp 6,67%.

Trong khi đó ở CT3 thời gian mẫu ngâm liên tục kéo dài làm cho hóa chất khử trùng thẩm thấu vào trong mô, gây chết mẫu đạt 16,67%.

Sử dụng Javen 5,7% trong 15 phút có tác dụng khử trùng bề mặt khá tốt, tỷ lệ mẫu nhiễm và hóa nâu tương ứng là 13,33% và 10%. Tuy nhiên số mẫu không có khả năng tái sinh lại cao nhất 26,67%.

Như vậy, khử trùng mẫu cấy với NADCC1% trong 15 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất 76,67%, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp 6,67%.

4.3.2. Xác định loại mẫu cấy thích hợp cho giai đoạn vào mẫu

Một dòng lai hoa lay ơn mới được tạo ra từ phép lai hữu tính sau khi trải qua 3 vụ từ gieo hạt đến củ bi, củ nhỡ và củ thương phẩm sẽ có số lượng vật liệu ban đầu tương đối ít. Trong đó có củ to với đường kính từ 3 – 4 cm và các củ con với đường kính dao động từ 0,5 – 2 cm. Với mục đích tạo ra được nhiều mẫu cấy mà không làm mất đi vật liệu ban đầu, chúng tôi tiến hành xác định chủng loại mẫu cấy thích hợp nhất để nhân nhanh dòng lai hoa lay ơn J11 dựa trên hai đường hướng tái sinh của mô tế bào: trực tiếp từ chồi chính, chồi bên và gián tiếp từ lát cắt củ.

Bảng 4.37. Ảnh hưởng của chủng loại mẫu cấy đến khả năng tái sinh chồi của dòng lai J11 (sau 4 tuần nuôi cấy)

CTTN

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu hóa nâu (%)	Tỷ lệ mẫu không phản ứng (%)	Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%)	Thời gian PSHT (ngày)	Số chồi/mẫu (chồi)	Đặc điểm chồi/mẫu phát sinh
CT1	26,7	16,7	0,0	60,0	10,5	4,3 ± 1,01a	Chồi mập, xanh đậm
CT2	13,3	6,7	16,7	63,3	21,7	1,1 ± 0,65b	Chồi nhỏ, xanh nhạt
CT3	10,0	13,3	0,0	76,7	12,3	4,5 ± 1,24a	Chồi mập, xanh đậm
CT4	10,0	6,7	26,7	56,7	15,1	1,2 ± 0,76b	Chồi nhỏ, xanh đậm
CT5	6,7	10,0	23,3	60,0	13,5	1,1 ± 0,84b	Chồi nhỏ, xanh đậm
CT6	23,3	63,3	13,4	0	35,3	0	Xuất hiện callus và lá
CT7	16,7	66,7	16,6	0	38,5	0	Xuất hiện callus và lá
CV (%)						7,1
LSD0,05						0,62

Ghi chú: CT1: Chồi chính của củ đường kính 3 – 4 cm;CT2: Chồi bên của củ đường kính 3 – 4 cm;CT3: Chồi chính của củ đường kính 1,5 – 3 cm;CT4: Chồi chính của củ đường kính 0,5 - 1,5 cm;CT5: Chồi chính của củ đường kính < 0,5 cm;CT6: Lát cắt của củ đường kính 3 – 4 cm;CT7: Lát cắt của củ đường kính 1,5 - 3 cm

Tỷ lệ mẫu nhiễm dao động từ 6,7 - 26,7%. Sử dụng mẫu cấy là củ con (CT3,CT4, CT5) cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp 6,7 - 10%.Tỷ lệ mẫu nhiễm đạt cao khi sử dụng chồi chính của củ có đường kính 3 - 4cm và lát cắt của củ lần lượt là 26,7% và 23,3% (Bảng 4.37).

Mẫu cấy là lát cắt củ sản sinh ra nhiều hợp chất thứ cấp làm cho mẫu bị hóa nâu, tỷ lệ này đạt từ 63,3 - 66,7% ở 2 công thức CT6 và CT7. Các công thức còn lại tỷ lệ mẫu hóa nâu chỉ từ 6,7 - 16,7%.

Tỷ lệ mẫu không phản ứng ở mức thấp với tất cả các công thức 0 - 26,7%.

Tuy nhiên đối với CT6 và CT7 mẫu cấy chỉ phát sinh callus và thể dạng lá

Khả năng tái sinh của mẫu đạt tương đối cao từ 56,7 - 76,7% ở các công thức sử dụng chồi chính và chồi bên. Thời gian phát sinh chồi ở các công thức sử dụng chồi chính khoảng 10 - 15 ngày. Bật chồi sớm nhất là CT1 mẫu cấy là chồi chính của củ đường kính 3 – 4 cm với 10,5 ngày. Trong khi đó các mẫu cấy sử dụng lát cắt củ phải cần 35 - 38 ngày để hình thành callus.

Đối với mẫu cấy là chồi bên và các củ có kích thước nhỏ, số lượng chồi tạo ra ít từ 1 - 2 chồi. Hai công thức còn lại sử dụng chồi chính thì ngoài chồi chính mọc ra, xung quanh xuất hiện thêm nhiều chồi kích thước nhỏ do đó số chồi mới tạo ra ở CT1 và CT3 lần lượt là 4,3 - 4,5 chồi/mẫu cấy.

Điều này tương đồng với nghiên cứu của Priykamari and Sheela (2005) nên sử dụng mẫu cấy là chồi của củ con có đường kính 0,8 - 2,1 cm. Chồi đỉnh có nhiều tế bào đang phân chia, việc bổ sung chất kích thích sinh trưởng sẽ góp phần tạo ra nhiều chồi mới hơn.

a b c d e f a chồi chính của củ có đường kính 3 4 cm b chồi bên 4

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)chồi chính của củ có đường kính 3 - 4 cm, (b)chồi bên của củ có đường kính 3 – 4 cm, (c) chồi chính của củ có đường kính 1,5 – 3 cm, (d) chồi chính của củ có đường kính 0,5 - 1,5 cm, (e) chồi chính của củ có đường kính < 0,5 cm, (f) lát cắt của củ có đường kính 3 – 4 cm

Hình 4.17. Khả năng phát sinh hình thái ở các chủng loại mẫu cấy khác nhau của dòng lai lay ơn J11

Về chất lượng chồi, các chồi mới tạo ra từ mẫu cấy chồi đỉnh có chất lượng tốt hơn chồi mập và màu xanh đậm

Tóm lại, Sử dụng mẫu cấy là chồi đỉnh của củ có đường kính 1,5 – 3 cm cho tỷ lệ nhiễm thấp 10%, tỷ thời gian phát sinh chồi nhanh, số chồi trung bình tạo ra là 4,5 chồi/mẫu.

4.3.3. Xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh

Với mục đích tạo cụm chồi từ mắt ngủ, việc cảm ứng ngủ nghỉ đóng vai trò rất quan trọng. Nhiều nghiên cứu cho thấy các chất điều tiết sinh trưởng là nhân tố thiết yếu trong cảm ứng ngủ nghỉ. Mối tương tác giữa auxin và cytokinin đối với sự hình thành chồi lay ơn được chúng tôi tiến hành giữa tỷ lệ BAP và α-NAA khác nhau.

Bảng 4.38. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP/ α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi hoa lay ơn (sau 6 tuần nuôi cấy)

CTTN

Thời gian phát sinh chồi (ngày)	Tỷ lệ mẫu hình thành chồi (%)	Tỷ lệ biến dị (%)	Số chồi/mẫu (chồi)	Đường kính chồi (cm)	Hình thái
CT1	13,2	83,3	0,0	3,3 ± 0,84e	0,26 ± 0,01a	Chồi mập, xanh đậm
CT2	16,5	66,7	6,7	2,1 ± 1,04fg	0,22 ± 0,02a	Chồi trung bình, xanh nhạt
CT3	23,5	43,3	16,7	1,2 ± 0,89gh	0,14 ± 0,02c	Chồi nhỏ, xanh nhạt
CT4	12,6	80,0	0,0	4,8 ± 1,21d	0,25 ± 0,02a	Chồi mập, xanh đậm
CT5	16,9	70,0	10,0	6,1 ± 1,01c	0,19 ± 0,02b	Chồi nhỏ, xanh đậm
CT6	17,1	56,7	23,3	2,7 ± 1,24ef	0,14 ± 0,01c	Chồi nhỏ, xanh nhạt, xuất hiện biến dị dạng lá
CT7	12,7	70,0	13,3	19,3 ± 2.2a	0,12 ± 0,02c	Chồi nhỏ, yếu, trắng xanh
CT8	15,4	43,3	26,7	12,1 ± 1,98b	0,12 ± 0,01c	Chồi nhỏ, yếu, trắng xanh
CT9	19,5	36,7	43,3	0,8 ± 0,67h	0,11 ± 0,01c	Chồi nhỏ, yếu, trắng xanh, xuất hiện biến dị dạng lá và callus
CV (%)				6,1	8,6
LSD0,05				1,21	0,03

Ghi chú: CT1: MS + 1mg/l BAP + 0,25mg/l α-NAA; CT2: MS + 1mg/l BAP + 0,5mg/l α-NAA; CT3: MS + 1mg/l BAP+ 0,75mg/l α-NAA; CT4: MS + 2mg/l BAP + 0,25mg/l α-NAA; CT5: MS + 2mg/l BAP

+ 0,5mg/l α-NAA; CT6: MS + 2mg/l BAP + 0,75mg/l α-NAA; CT7: MS + 3mg/l BAP + 0,25mg/l α- NAA; CT8: MS + 3mg/l BAP + 0,5mg/l α-NAA; CT9: MS + 3mg/l BAP + 0,75mg/l α-NAA.

Thời gian phát sinh chồi rất sớm ở CT1, CT4 và CT7 là 12,6 - 12,7 - 13,2 ngày, dài nhất ở CT3 là 23,5 ngày, các công thức còn lại dao động từ 15,4 - 19,5 ngày. Ở cùng nồng độ BAP, thời gian phát sinh chồi dài hơn khi tăng nồng độ α- NAA. Mặt khác ở các công thức BAP khác nhau cần thời gian tương đương nhau để hình thành chồi.

Tỷ lệ phát sinh chồi ở các công thức có nồng độ BAP từ 1 - 2 mg/l là khá cao khoảng 43,3 - 83,3%. Tuy nhiên tăng nồng độ α-NAA thì tỷ lệ này giảm dần, xuất hiện nhiều biến dị dạng lá và callus. Cụ thể CT1, CT2, CT3 (cùng nồng độ BAP và tăng α-NAA) có tỷ lệ hình thành chồi là 83,8; 66,7; 43,3% và tỷ lệ biến dị tương ứng là 0; 6,7; 16,7%. Như vậy nồng độ auxin α-NAA thấp cho kết quả tạo chồi từ mắt ngủ cao hơn.

(a) 1 mg/lBAP – 0,25/0,5/0,75 mg/l αNAA

(d) 0,25 mg/l αNAA – 1/2/3 mg/l BAP

(b) 2 mg/lBAP – 0,25/0,5/0,75 mg/l αNAA

(e) 0,5 mg/l αNAA – 1/2/3 mg/l BAP

(f) 0,75 mg/l αNAA – 1/2/3 mg/l BAP

Hình 4.18. Khả năng nhân nhanh tạo cụm chồi của dòng lai lay ơn J11 trên các môi trường khác nhau

Việc tăng hàm lượng Xytokinin làm tăng số lượng chồi/mẫu đã được công bố trong các nghiên cứu của Priyakumari & Sheela (2005), Memon & cs. (2014), Tripathi & cs. (2017) và Devi & cs. (2019). Trong nghiên cứu này số chồi/mẫu nhiều nhất ở CT7 là 19,3 chồi. Hàm lượng BAP cao kích thích mẫu phát sinh nhiều chồi nhưng chồi nhỏ, đường kính chồi 0,12 cm, yếu, màu trắng xanh. Đồng thời tăng cả lượng α-NAA làm cho mẫu cấy phát sinh nhiều thể không định hình (callus), không hình thành chồi hoặc số lượng ít.Xét về chất lượng chồi thì CT1 và CT4 ở mức tương đương nhau: Chồi xanh, mập, đường kính 0,25 - 0,26 cm. Tuy nhiên số chồi phát sinh ở CT4 nhiều hơn CT1 tương ứng là 4,8 và 3,3 chồi.

Như vậy công thức tốt nhất cho sự tạo chồi từ mắt ngủ là: MS + 3% sucrose

+ 2 mg/l BAP + 0,25 mg/lα-NAA. Với tỷ lệ mẫu tạo chồi là 80%, số chồi/mẫu là 4,8 chồi.

4.3.4. Xác định môi trường tạo củ thích hợp

Đã có nhiều báo cáo về ảnh hưởng của IBA lên khả năng tạo củ của những giống lay ơn khác nhau, Memon & cs. (2014) đã kết luận môi trường MS bổ sung 1 mg/l IBA và 5% sucrose có tác dụng tốt nhất cho sự hình thành củ lay ơn in vitro. Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt & cs.(2007) trên giống lay ơn màu hồng san hô cũng cho thấy sử dụng IBA ở nồng độ 0,375 mg/l có ảnh hưởng tốt lên sự hình thành củ in vitro.

Bằng thực nghiệm nhân giống các giống lay ơn thương phẩm cho thấy các giống khác nhau có phản ứng khác nhau với môi trường tạo củ lay ơn. Do đó, ở thí nghiệm này các nồng độ IBA và hai loại môi trường nền được khảo sát để tìm ra môi trường thích hợp nhất cho khả năng tạo củ lay ơn in vitro dòng lai J11.

Kết quả từ bảng 4.39 cho thấy, ở tất cả các công thức có tỷ lệ hình thành củ đạt cao từ 70 - 96%. Như vậy auxin IBA có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tạo củ của dòng lai J11.

Tuy nhiên khi nồng độ IBA tăng lên thì tỷ lệ tạo củ có xu hướng giảm xuống. Theo Begum & Haddiuzaman(1995) nghiên cứu sau khi hình thành rễ, củ được tạo ra từ phần đế chồi sau 6 - 10 tuần. Do đó, chỉ cần bổ sung một lượng nhỏ auxin ngoại sinh kích thích phát sinh rễ củ vào trong môi trường. Nếu lượng auxin ngoại sinh kết hợp với auxin nội sinh tạo ra nhiều sẽ gây ra phản ứng đối nghích, ức chế hình thành củ.

Bảng 4.39. Kết quả tạo củ lay ơn in vitro dòng lai J11 trên các môi trường và nồng độ IBA khác nhau (sau 18 tuần nuôi cấy)

Tỉ lệ mẫu hình thành củ (%)	Thời gian thu hoạch (ngày)			Phân loại củ theo đường kính củ(%)
Tỉ lệ mẫu hình thành củ (%)	Thời gian thu hoạch (ngày)	CTTN	Khối lượng củ (g)	Đường kính củ (cm)	Loại I 1-1,5 cm	Loại II 0,5-1 cm	Loại III <0,5 cm
CT1	93,0	102,3	0,43 ± 0,02d	0,37 ± 0,06d	0	0	100
CT2	92,7	104,5	0,55 ± 0,04c	0,48 ± 0,05c	0	11,1	88,9
CT3	88,0	111,2	0,37 ± 0,06d	0,35 ± 0,06d	0	0	100
CT4	76,0	112,5	0,37 ± 0,07d	0,22 ± 0,03e	0	0	100
CT5	70,0	103,2	0,25 ± 0,05e	0,21 ± 0,08e	0	0	100
CT6	96,0	108,4	0,57 ± 0,02c	0,61 ± 0,05b	9,5	55,4	35,1
CT7	92,0	114,7	0,77 ± 0,03a	0,78 ± 0,05a	20,5	64,8	14,7
CT8	84,7	118,5	0,67 ± 0,05b	0,65 ± 0,07ab	7	47,7	45,3
CT9	81,3	126,5	0,61 ± 0,06bc	0,62 ± 0,03b	8,4	33,5	58,1
CT10	75,3	119,3	0,55 ± 0,07c	0,61 ± 0,04b	6,1	28,2	65,7
CV%			7,24	8,11
LSD0,05			0,06	0,07

Ghi chú: CT1: ½ MS + 0,5mg/l IBA;CT2: ½ MS + 1 mg/l IBA;CT3: ½ MS + 1,5mg/l IBA;CT4: ½ MS + 2 mg/l IBA;CT5: ½ MS + 2,5mg/l IBA;CT6: MS + 0,5mg/l IBA;CT7: MS + 1 mg/l IBA;CT8: MS +

1,5mg/l IBA;CT9: MS + 2 mg/l IBA;CT10: MS + 2,5mg/l IBA

Thời gian thu hoạch củ dao động từ 102,3-126,5 ngày. Môi trường 1/2MS có thời gian thu củ ngắn hơn từ 102,3 - 112,5 ngày. Lượng dinh dưỡng nhiều hơn giúp cây duy trì bộ lá lâu và củ cần nhiều thời gian để tăng kích thước hơn, thời gian thu hoạch củ khi sử dụng môi trường MS dao động từ 108,4 - 126,5 ngày.

Chất lượng củ giống tạo ra chênh lệch giữa hai loại môi trường nền. Sử dụng 1/2MS có trọng lượng củ trung bình từ 0,25 - 0,55 g, đường kính củ từ 0,21

- 0,48 cm. Môi trường nền MS cho củ có chất lượng củ tốt hơn với trọng lượng củ đạt từ 0,55 - 0,77 g và đường kính củ từ 0,61 - 0,78 cm.

Củ giống in vitro được phân loại thành 3 nhóm tương ứng với đường kính củ từ < 0,5 cm; 0,5 – 1 cm; 1 - 1,5 cm. Môi trường nền 1/2MS cho củ con thu được có kích thước nhỏ < 0,5 chiếm từ 88,9 - 100%. Tỷ lệ củ con có đường kính 0,5 – 1 cm chiếm ưu thế ở môi trương nền MS từ 28,2 - 64,8%.