Phân Nhóm Quan Hệ Của Trình Tự Các Mẫu Phân Lập B. Thuringiensis

Hình 3.10 Phân nhóm quan hệ của trình tự các mẫu phân lập B. thuringiensis

var. kurstaki và các trình tự gen cry từ cơ sở dữ liệu GenBank.

Sơ đồ được xây dựng dựa trên phương pháp Maximum Likelihood và mô hình thông số Kimura 2 với 1000 lần lặp lại (bootstrap n = 1000). Tỷ lệ lặp lại của các nhóm phân loại được thể hiện ở các nhánh.

Các gen cry1, cry2 được các tác giả Việt Nam tập trung nghiên cứu nhiều hơn so với các gen khác như cry4 và cry9. Trong khi đó, gen cry9 được các nhà khoa học ngoài nước nghiên cứu và phát hiện các gen mới (Ben Dov và ctv, 1997; Bravo và ctv, 1998; Patel và ctv, 2011). Theo Shu và ctv (2013), gen cry9 có khả năng hỗ trợ cho việc gây bệnh các loài sâu hại có tính kháng các dòng cry1 (Tabashnik và ctv, 2000).

354 bp

M + – 1 2 3 4 5 6 7 8 9

M + – 10 11 12 13 14 15 16

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp primer UN9F – UN9R

M: thang chuẩn 100 bp; (1) dòng VBt26310.3; (2) dòng VBt26311.1; (3) dòng

VBt26312.2; (4) dòng VBt26313.2; (5) dòng VBt26314.5; (6) dòng VBt26310; (7)

dòng VBt26315.4; (8) dòng VBt26316.2; (9) dòng VBt26317.5; (10) dòng VBt26318.2; (11) dòng VBt26321.4; (12) dòng VBt26325.3; (13) dòng VBt26327.1;

(14) dòng VBt 26327.2; (15) dòng VBt26322.5; (16) dòng VBt26318.5

So với các công bố trong và ngoài nước, cho thấy tần suất xuất hiện của gen cry1, cry2 và cry4 tương đối cao và thường xuất hiện cùng nhau. Gen cry9 có tần suất xuất hiện tương đối thấp 0,1%, còn các nghiên cứu của các tác giả ngoài nước có tần xuất từ 2,6% – 15,5% (Ben Dov và ctv, 1997; Bravo và ctv, 1998; Zhang và ctv, 2000; Wang và ctv, 2003; ), và ít xuất hiện cùng gen cry1 và cry2. Ben Dov và ctv (1999) đã phát hiện rằng trong số các mẫu có gen cry9 thì cǜng hiện diện một hoặc cả hai gen cry1 và gen cry2.

3.3 Xác định sự hiện diện gen vip3a của vi khuẩnB. thuringiensis var. kurstaki

Các dòng vi khuẩn B. thuringiensis được nuôi cấy trên môi trường LB trong 72 – 96 giờ, sau đó tiến hành nhuộm bào tử và tinh thể. Kết quả cho thấy, tất cả các dòng đều có sự xuất hiện bào tử, tuy nhiên có 5 trong 10 dòng có khả năng tạo tinh thể (VBt2119.1; VBt21110.1; VBt2735.1; VBt2736.2 và VBt27510.2) và các dòng

này đều cho tinh thể dạng hình thoi. Từ các dòng tạo tinh thể hình thoi (VBt2119.1; VBt21110.1; VBt2735.1; VBt2736.2 và VBt27510.2) tiến hành kiểm tra sự biểu hiện của protein Vip3a

Hình 3.12 Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của protein Vip3a trên gel SDS- polyacrylamide 12%.

Ghi chú: (1) Đối chứng dương; (2) dòng VBt2119.1; (3) dòng VBt21110.1; (4) dòng VBt2735.1; (5) dòng VBt2736.2; (6) dòng VBtT10.2; (7) đối chứng âm; LD : thang protein chuẩn 10 – 200 kDa.(Promega)

Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy có 5 mẫu (VBt2119.1, VBt21110.1, VBt2735.1, VBt2736.2 và VBt27510.2) có sản phẩm khuếch đại với kích thước khoảng 66 kDa (Hình 3.12). Tất cả các chủng đều có sự xuất hiện bào tử, tuy nhiên chỉ có 5 chủng (VBt2119.1, VBt21110.1, VBt2735.1, VBt2736.2 và VBt27510.2) trong 10 chủng (VBt2119.1, VBt21110.1, VBt2751.3, VBt27510.2, VBt2736.2,

VBt2735.1, VBt2751, VBt26313.2, VBt26311.1, VBt26323.1) có khả năng tạo tinh thể và các chủng này đều cho tinh thể dạng hình thoi. Các chủng không sinh tinh thể

đều không cho sản phẩm ở phản ứng PCR. Điều này chứng minh khả năng sinh tinh thể độc có liên quan mật thiết với sự hiện diện của các gen gây độc nói chung và gen vip3a nói riêng.

10 11

27 bp

Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng gen vip3a

M thang protein chuẩn 10 – 200 kDa.(Promega); (1) dòng VBt2119.1; (2) dòng

VBt21110.1; (3) dòng VBt2751.3; (4) dòng VBt27510.2; (5) dòng VBt2736.2; (6) dòng

VBt2735.1; (7) dòng VBt2751.2; (8) dòng VBt26313.2; (9) dòng VBt26311.1; (10) dòng

VBt26323.1; (11) đối chứng dương.

So với các gen gây độc khác như cry hay cyt, vip3a có khả năng diệt nhiều loài côn trùng hơn. Bên cạnh đó, vip3a còn có khả năng kiểm soát một số đối tượng côn trùng kháng với các gen cry1 hoặc cry2 (Estruch và ctv, 1996; Lee và ctv, 2003). Yu và ctv (2011) đã phân lập từ 1.789 mẫu đất được 2.134 chủng B. thuringiensis mang 3 gen vip gồm vip3 (67,4%), vip2 (14,6%), vip1 (8,1%). Gen vip3a rất được quan tâm trên thế giới trong việc tạo ra chế phẩm sinh học trong khi tại Việt Nam, gen vip ít được nghiên cứu so với các gen cry hay cyt.

3.4 Khả năng gây chết sâu khoang (Spodoptera litura), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) của các chủng vi khuẩn B. thuringiensis var. kurstaki phân lập

Từ 261 mẫu vi khuẩn sinh tinh thể đã xác định được 20 chủng vi khuẩn

mang gen cry1, cry2, cry4, cry9 và vip3a phân lập ở các tỉnh Vĩnh Phúc, Lâm Đồng, Thành phố Hồ Chí Minh, Tây Ninh, Tiền Giang và Bến Tre. Một ngày sau xử lý, ghi nhận có sâu chết và tăng dần đến ngày thứ 7 sau xử lý.

Bảng 3.6 Hiệu quả gây chết (%) sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng vi khuẩn

B. thuringiensis var. kurstaki

Số TT

Chủng vi khuẩn	1 NSXL	3 NSXL	5 NSXL	7 NSXL
1	VBt246.1	27,5 abc	45,0 ab	52,5 bc	60,0 cde
2	VBt2413.1	17,5 cbd	25,0 de	40,0 cd	55,0 cd
3	VBt2119.1	25,0 abcd	40,0 abcd	70,0 ab	77,5 ab
4	VBt21110.1	32,5 a	50,0 a	75,0 a	82,5 a
5	VBt25211.1	12,5 de	25,0 de	42,5 cd	57,5 cde
6	VBt281.3	27,5 abc	42,5 abc	70,0 ab	77,5 ab
7	VBt283.2	15,0 cd	32,5 bcde	45,0 cd	62,5 cd
8	VBt2847	22,5 abcd	40,0 abcd	62,5 b	67,5 bc
9	VBt2639.5	17,5 cbd	27,5 cde	35,0 d	50,0 d
10	VBt26317.2	15,0 cd	22,5 e	40,0 cd	50,0 d
11	VBt26310.1	25,0 abcd	45,0 ab	70,0 ab	77,5 ab
12	VBt2736.2	30,0 ab	50,0 a	72,5 a	80,0 a
13	VBt27310	12,5 de	30,0 bcde	50,0 c	55,0 cd
14	VBt2735.1	22,5 abcd	35,0 abcde	67,5 ab	77,5 ab
15	VBt2751	22,5 abcd	42,5 abc	62,5 b	75,0 ab
16	VBt2752.2	20,0 abcd	40,0 abcd	65,0 ab	75,0 ab
17	VBt2762.1	30,0 ab	42,5 abc	70,0 ab	75,0 ab
18	VBt2767.6	32,5 a	50,0 a	70,0 ab	80,0 a
19	VBt27510	20,0 abcd	35,0 abcde	62,5 ab	75,0 ab
20	VBt27611 ĐC	12,5 de 0,0 f	20,0 e 0,0 f	40,0 cd 0,0 f	52,5 cd 0,0 f
	Mức ý nghĩa	**	**	**	**
	CV (%)	2,9	2,0	1,2	1,2

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 262 trang tài liệu này.

Bảng 3.7 Hiệu quả gây chết (%) sâu khoang (Spodoptera litura) của các chủng vi khuẩn B. thuringiensis var. kurstaki

Số TT

NT	1 NSXL	3 NSXL	5 NSXL	7 NSXL
1	VBt246.1	17,5 d-g	30,0 d-g	45,0 def	55,0 def
2	VBt2413.1	7,5 g	17,5 g	30,0 g	42,5 g
3	VBt2119.1	30,0 a-d	52,5 ab	62,5 ab	72,5 abc
4	VBt21110.1	35,0 ab	47,5 abc	65,0 a	77,5 a
5	VBt25211.1	17,5 d-g	30,0 d-g	50,0 b-e	57,5 def
6	VBt281.3	22,5 b-e	42,5 a-d	60,0 abc	65,0 bcd
7	VBt283.2	7,5 g	22,5 fg	40,0 fg	50,0 fg
8	VBt2847	15,0 efg	27,5 efg	42,5 efg	55,0 def
9	VBt2639.5	10,0 fg	30,0 d-g	40,0 fg	52,5 efg
10	VBt26317.2	17,5 d-g	27,5 efg	42,5 efg	57,5 def
11	VBt26310.1	32,5 abc	55,0 a	67,5 a	80,0 a
12	VBt2736.2	32,5 abc	55,0 a	60,0 abc	72,5 abc
13	VBt27310	22,5 b-e	35,0 c-f	47,5 c-f	52,5 efg
14	VBt2735.1	37,5 a	52,5 ab	67,5 a	77,5 a
15	VBt2751	25,0 a-e	47,5 abc	60,0 abc	75,0 ab
16	VBt2752.2	20,0 c-f	40,0 b-e	55,0 a-d	70,0 abc
17	VBt2762.1	17,5 d-g	42,5 a-d	60,0 abc	77,5 a
18	VBt2767.6	27,5 a-e	50,0 ab	65,0 a	70,0 abc
19	VBt27510	25,0 a-e	47,5 abc	57,5 a-d	70,0 abc
20	VBt27611 ĐC	27,5 a-e 0,0 h	40,0 b-e 0,0 h	47,5 c-f 0,0 h	62,5 cde 0,0 h
	Mức ý nghĩa	**	**	**	**
	CV (%)	2,3	1,6	1,4	1,3

Bảng 3.8 Hiệu quả gây chết (%) sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) của các chủng vi khuẩn B. thuringiensis var. kurstaki

Số TT

NT	1 NSXL	3 NSXL	5 NSXL	7 NSXL
1	VBt246.1	10,0 f	22,5 de	32,5 e	42,5 def
2	VBt2413.1	20,0 b-f	27,5 cde	30,0 e	40,0 ef
3	VBt2119.1	27,5 abc	37,5 abc	67,5 a	70,0 ab
4	VBt21110.1	15,0 def	47,5 a	65,0 ab	72,5 a
5	VBt25211.1	12,5 ef	22,5 de	30,0 e	67,5 ab
6	VBt281.3	22,5 a-e	45,0 ab	65,0 ab	70,0 ab
7	VBt283.2	22,5 a-e	32,5 b-e	47,5 cd	52,5 cd
8	VBt2847	17,5 cde	27,5 cde	40,0 de	50,0 cde
9	VBt2639.5	12,5 ef	27,5 cde	40,0 de	45,0 def
10	VBt26317.2	15,0 def	27,5 cde	35,0 e	50,0 cde
11	VBt26310.1	30,0 ab	35,0 a-d	67,5 a	75,0 a
12	VBt2736.2	25,0 a-d	35,0 a-d	65,0 ab	75,0 a
13	VBt27310	32,5 a	37,5 abc	57,5 abc	60,0 bc
14	VBt2735.1	22,5 a-e	47,5 a	65,0 ab	75,0 a
15	VBt2751	30,0 ab	42,5 ab	60,0 ab	70,0 ab
16	VBt2752.2	17,5 cde	37,5 abc	55,0 bc	70,0 ab
17	VBt2762.1	20,0 b-f	45,0 ab	65,0 ab	65,0 ab
18	VBt2767.6	15,0 def	40,0 abc	60,0 ab	72,5 a
19	VBt27510	15,0 def	32,5 b-e	55,0 bc	65,0 ab
20	VBt27611 ĐC	12,5 ef 0,0 g	20,0 e 0,0 f	30,0 e 0,0 f	42,5 def 0,0 g
Mức ý nghĩa		**	**	**	**
CV (%)		8,6	2,0	1,2	1,2

Có 11 chủng vi khuẩn gây chết 75 – 80% sâu tơ, cao nhất là các chủng VBt21110.1 (phân lập từ tỉnh Vĩnh Phúc), VBt2736.2 (Tiền Giang), VBt2767.6 (Tây Ninh) và VBt26310.1 (Lâm Đồng) (Bảng 3.6).

Hai mươi chủng vi khuẩn đều có khả năng diệt sâu khoang. Ở ngày thứ 7 sau xử lý, chủng VBt26310.1 có hiệu lực diệt sâu cao nhất là 80,0% (Bảng 3.7).

Đối với sâu xanh da láng, 3 chủng VBt26310.1 (thu thập ở Lâm Đồng) VBt2736.2 và chủng VBt2735.1 (Tiền Giang) đạt hiệu lực diệt sâu 75,0% cao hơn các chủng còn lại (Bảng 3.8).

Hiệu lực diệt sâu tơ, sâu khoang và sâu xanh da láng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu đạt từ 72 – 80%. Một số mẫu vi khuẩn B. thuringiensis gen cry1 và cry2 có khả năng diệt sâu tơ, sâu khoang và sâu xanh da láng như VBt2110.1 (mẫu phân lập từ tỉnh Vĩnh Phúc mang cry1, cry2 và vip3a), VBt26317.2 (Lâm Đồng, cry1 cry2), VBt2735.1 (Tiền Giang, cry1, cry2 và vip3a), VBt2767.6 (Tây Ninh, cry1 và cry2) là các chủng có hiệu lực gây chết sâu cao.

Hình 3.14 Sâu tơ chết do vi khuẩn B. thuringiensis var. kurstaki

(1) Sau 12 giờ; (2) Sau 24 giờ; (3) Sau 48 giờ; (4) Sau 72 giờ.