VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM |
Có thể bạn quan tâm!
-
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas9 trong tạo đột biến gen GmGOLS03, GmGOLS19 trên cây đậu tương Glycine max L. Merrill nhằm giảm lượng đường họ Raffinose trong hạt - 2 -
Tình Hình Sản Xuất Và Chọn Tạo Giống Đậu Tương -
Cấu Tạo Và Mối Liên Hệ Của Các Đường Thuộc Họ Raffinose
Xem toàn bộ 122 trang tài liệu này.
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ THỊ NHƯ THẢO
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
----------------------------- LÊ THỊ NHƯ THẢO
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ CRISPR/CAS9 TRONG TẠO ĐỘT BIẾN GEN GmGOLS03, GmGOLS19 TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) NHẰM GIẢM LƯỢNG ĐƯỜNG HỌ RAFFINOSE TRONG HẠT
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã sỗ: 9 42 02 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. ĐỖ TIẾN PHÁT
2. PGS. TS. PHẠM BÍCH NGỌC
Hà Nội – 2022
Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và ngoài một số kết quả nhóm nghiên cứu đã công bố, chưa có ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả
LÊ THỊ NHƯ THẢO
LỜI CẢM ƠN
Luận án của nghiên cứu sinh được hoàn thành với sự giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình của các cơ quan nghiên cứu trong nước, các cơ quan đoàn thể, quí đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tác giả xin trân trọng gửi lời cảm ơn và tri ân đến:
- PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và TS. Đỗ Tiến Phát với cương vị giáo viên hướng dẫn khoa học, đã tận tình hướng dẫn đóng góp trong nghiên cứu cũng như luận án của nghiên cứu sinh.
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã cấp kinh phí để thực hiện đề tài.
- Quí Lãnh Đạo Viện Công nghệ sinh học cùng Quí Thầy – Cô của Viện và các cán bộ nghiên cứu của phòng Công nghệ tế bào thực vật, đã quan tâm giúp đỡ, định hướng, tạo điều kiện tốt cho nghiên cứu sinh thực hiện các thí nghiệm và hoàn thành luận án.
- Ban Lãnh Đạo và cán bộ phòng Đào tạo Học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện để nghiên cứu sinh hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ sự biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Cao đẳng Nông nghiệp Nam Bộ, Khoa Trồng trọt – Bảo vệ Thực vật và các Anh chị em đồng nghiệp nhà trường đã tạo điều kiện, hỗ trợ cho tôi hoàn thành khoá học.
- Cuối cùng, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, Quí Anh/chị/em, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi an tâm, hoàn thành tốt luận án!
Hà Nội, ngày.......tháng.......năm 2022
LÊ THỊ NHƯ THẢO
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ix
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ x
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu của đề tài 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3
4. Những đóng góp mới của luận án 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4
1.1 Tình hình sản xuất và chọn tạo giống đậu tương 4
1.1.1 Tình hình sản xuất 4
1.1.2 Các phương pháp phổ biến sử dụng trong chọn tạo giống đậu tương 7
1.2 Sinh tổng hợp đường khó tiêu raffinose (raffinose family oligosaccharide) trong cây đậu tương 10
1.2.1. Nhóm đường khó tiêu raffinose trong thành phần hạt đậu tương 10
1.2.2 Con đường sinh tổng hợp RFOs trong cây đậu tương và các enzymes
tham gia 14
1.2.3 Gen mã hóa cho Galactinol synthase (GOLS) trong đậu tương 16
1.2.4 Nghiên cứu thay đổi hàm lượng RFOs trên cây đậu tương 17
1.3. Chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống CRISRP/Cas9 17
1.3.1. Nguyên lý hoạt động của hệ thống CRISRP/Cas 18
1.3.2. Cơ chế hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen CRISRP/Cas9 19
1.3.3. Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 trong chọn tạo giống ở đậu tương 22
1.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa hệ gen 24
1.4. Hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ và ứng dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa hệ gen trên đậu tương 25
1.4.1. Hệ thống cảm ứng rễ tơ ở thực vật 25
1.4.2. Nghiên cứu biểu hiện gen và chỉnh sửa hệ gen trên đậu tương 27
1.5 Những nghiên cứu trong và ngoài nước có liên quan trực tiếp đến luận án 28
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 29
2.1 Vật liệu nghiên cứu 29
2.2 Nội dung nghiên cứu 30
2.3 Phương pháp nghiên cứu 30
2.3.1 Thiết kế vector chuyển gen mang hệ thống CRISPR/Cas9 30
2.3.2. Cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A. Rhizogenes 31
2.3.3. Kiểm tra sự có mặt và biểu hiện của gen chỉ thị và gen chọn lọc trong rễ
tơ đậu tương 33
2.3.4. Xác định và phân tích đột biến định hướng trên các gen đích của các
dòng rễ tơ đậu tương 33
2.3.5 Chuyển gen tạo cây đậu tương mang cấu trúc CRISPR/Cas9 35
2.3.6 Phương pháp trồng và chăm sóc cây đậu tương trong điều kiện nhà
lưới 37
2.3.7 Phân tích sự di truyền của đột biến định hướng và gen chuyển các dòng đậu tương chỉnh sửa gen 37
2.3.8 Kiểm tra độ nảy mầm của hạt 40
2.3.9 Xác định thành phần hạt 40
2.3.10 Phân tích các đột biến ngoài mục tiêu (off target) 41
2.3.11 Phân tích thống kê 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42
3.1 Thiết kế hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến
các gen GmGOLS trên đậu tương 42
3.2 Kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và chỉnh sửa
gen CRISPR/Cas9 thông qua hệ thống cảm ứng rễ tơ 45
3.2.1 Phát triển hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trong điều kiện in vitro trên một số giống đậu tương 45
3.2.2. Kiểm tra hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 trên các
dòng rễ tơ 51
3.3 Tạo cây đậu tương đột biến gen mã hóa Galactinol synthase 54
3.3.1 Tạo cây đậu tương chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 54
3.3.2 Sàng lọc cây chuyển gen bằng phết thuốc diệt cỏ và PCR 55
3.3.3 Xác định và phân tích các đột biến gen thu được trên cây đậu tương chuyển gen T0 56
3.4 Sàng lọc các dòng đậu tương chỉnh sửa gen qua các thế hệ T1 và T2
................................................................................................................... 59
3.4.1 Dòng DT 1.1 của giống ĐT26 59
3.4.2 Các dòng M3.1 và M4.1 của giống Marverick 63
3.5 Phân tích sinh trưởng phát triển và thành phần hạt của các dòng
đậu tương mang đột biến định hướng 71
3.5.1 Phân tích sinh trưởng, phát triển và hình thái của các dòng đậu tương mang đột biến 71
3.5.2 Phân tích khả năng nảy mầm của các dòng đột biến gen 73
3.5.3 Phân tích thành phần của hạt của các dòng đậu tương mang đột biến 74
3.6. Kiểm tra đột biến ngoài định hướng và lựa chọn dòng đột biến tiềm năng không mang gen chuyển 79
3.6.1 Phân tích đột biến ngoài mục tiêu (off target) 79
3.6.2 Xác định các đột biến đồng hợp tử không mang gen chuyển 80
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN 82
4.1 Hiệu quả của hệ thống cảm ứng tạo rễ tơ trên các giống đậu tương Việt Nam 82
4.2 Chọn trình tự mục tiêu trong thiết kế cấu trúc chỉnh sửa gen trên
đậu tương 83
4.3 Khả năng xuất hiện đột biến định hướng muộn thông qua hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 84
4.4 Đột biến gen GmGOLS và sự nảy mầm của hạt đậu tương 85
4.5 Đột biến gen GmGOLS ảnh hướng đến sự thay đổi của hàm
lượng cacbohydrat có trong hạt 85
4.6 Tiềm năng trong chọn tạo giống đậu tương thông qua hệ thống chỉnh sửa hệ gen 87
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88
TÀI LIỆU THAM KHẢO 90
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 100
PHỤ LỤC 101