Tác Nhân Khử Trùng, Nồng Độ Kết Hợp Với Thời Gian Xử Lý Trong Khử Trùng

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Công nghệ sinh học thực vật - đặc biệt là phương pháp nuôi cấy tế bào, mô và cơ quan thực vật trên môi trường dinh dưỡng được kiểm soát - đã khắc phục được những khó khăn của phương pháp nhân giống truyền thống [101]. Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra được số lượng lớn cây trồng đồng nhất về mặt di truyền, tạo ra nguồn giống sạch bệnh, bảo tồn và phát triển nguồn gene cũng như nghiên cứu các đặc tính sinh lý của thực vật. Nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật bao gồm cảm ứng mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh phôi, tái sinh chồi, hình thành rễ,... Sự thành công của các phương pháp này phụ thuộc vào một số yếu tố như kiểu gene, loại mẫu cấy, phương pháp khử trùng bề mặt, thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, hệ thống nuôi cấy, quang chu kỳ,... Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm mang lại thì phương pháp này vẫn còn tồn tại một số hạn chế như quá trình khử trùng bề mặt mẫu cấy bị nhiễm vi sinh vật ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh, hiệu quả của các quá trình phát sinh hình thái không cao, sự tích luỹ khí ethylene ảnh hưởng đến hiệu quả nhân giống, chất lượng cây giống và tỷ lệ sống sót khi thuần hoá ở vườn ươm thấp, giá thành cây giống cao [84], [40]. Do đó việc ứng dụng các nguồn vật liệu mới cũng như cải tiến môi trường và điều kiện nuôi cấy nhằm nâng cao chất lượng cây giống vẫn luôn là một trong những mục tiêu của vi nhân giống thương mại.

Chúng ta đang sống trong thời đại mà công nghệ nano được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như vật lý, hoá học, điện tử, môi trường, năng lượng, vật liệu, sinh học [108]. Trong những năm gần đây, tương tác giữa các vật liệu nano với thực vật đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Rất nhiều các nghiên cứu về tác động của các loại hạt nano lên hệ thống thực vật đã được tiến hành. Các nhà nghiên cứu đã cho thấy thành phần, cấu trúc, nồng độ hạt nano có ảnh hưởng tích cực và tiêu cực khác nhau đến sinh trưởng, phát triển thực vật [85]. Tác động tích cực đáng kể của các hạt nano lên thực vật đã được chứng minh thông qua khả năng gia tăng tỷ lệ nảy mầm, tăng cường sinh trưởng và các hoạt động sinh lý, ngăn ngừa bệnh

hại, sự sản sinh ethylene và sự rụng các cơ quan sinh sản, tăng sản lượng và năng suất cây trồng cũng như tăng cường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp có giá trị như dược phẩm, chất dinh dưỡng và hóa chất nông nghiệp [178], [135], [66]. Từ đó, một loạt các ứng dụng có thể thương mại hóa liên quan tới việc triển khai các hạt nano trong nông nghiệp đã được phát triển một cách nhanh chóng để cải thiện chất lượng cây trồng, hạn chế việc sử dụng dư thừa thuốc trừ sâu, phân bón hóa học. Song song với việc sử dụng các hệ thống nuôi cấy tiên tiến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (hệ thống thoáng khí, bioreactor, vi thủy canh, hệ thống chiếu sáng đơn sắc,…) nhằm cải thiện điều kiện nuôi cấy để khắc phục một số hạn chế còn tồn tại trong vi nhân giống thường quy, các hạt nano cũng đã bắt đầu được đầu tư nghiên cứu và cho thấy tiềm năng ứng dụng cao trong việc kháng khuẩn và cải thiện chất lượng cây giống (khả năng hấp thu ánh sáng, tăng cường quang hợp, điều khiển sinh trưởng, phát triển thực vật) [155]. Chính vì vậy, để hiểu rõ vai trò và tiềm năng của nano trong việc khử trùng, bổ sung như một chất điều hoà sinh trưởng và thay thế dinh dưỡng khoáng nhằm cải thiện các nhược điểm trong hệ thống vi nhân giống, nâng cao chất lượng cây giống nuôi cấy mô, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitroở một số cây trồng có giá trị kinh tế”. Trong nghiên cứu này, các cây trồng được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu là salem (Limonium sinuatum) - một loài hoa cắt cành phổ biến, dâu tây (Fragaria

× ananassa) - cây ăn trái có giá trị kinh tế gắn liền với du lịch của thành phố Đà Lạt và sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) - loài cây dược liệu đặc hữu của Việt Nam.

Mục tiêu đề tài

Mục tiêu tổng quát

Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá tác động của các hạt nano bạc (AgNPs) - được sử dụng khử trùng bề mặt mẫu lá và bổ sung vào môi trường nuôi cấy, các hạt nano sắt (FeNPs) - được sử dụng thay thế sắt-Ethylenediamine Tetra Acetate (Fe- EDTA) trong quá trình vi nhân giống lên chất lượng cây giống trên một số loại cây trồng có giá trị kinh tế (salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh).

Mục tiêu cụ thể

Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên hiệu quả khử trùng bề mặt mẫu lá cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh và so sánh với các chất khử trùng truyền thống [calcium hypochlorite [Ca(ClO)2], chlorua thủy ngân (HgCl2)].

Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái (phát sinh phôi, tái sinh chồi, gia tăng số lượng tế bào) cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.

Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình hình thành cây hoàn chỉnh cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.

Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs được hấp thu đến sự biến động khí ethylene tích luỹ trong quá trình hình thành rễ cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.

Đánh giá khả năng thích nghi và sinh trưởng cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh ở giai đoạn ex vitro có nguồn gốc từ nghiệm thức tốt nhất của AgNPs và FeNPs trong nuôi cấy in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

AgNPs (sử dụng làm chất khử trùng và bổ sung vào môi trường nuôi cấy), FeNPs (thay thế Fe-EDTA trong môi trường nuôi cấy) với các nồng độ khác nhau được sử dụng để nghiên cứu khả năng khử trùng, sự sinh trưởng, phát triển và nâng cao chất lượng cây giống cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro.

Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên các giai đoạn khử trùng bề mặt, phát sinh hình thái trong vi nhân giống cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh.

Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh trên ba đối tượng cây trồng (salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh) nuôi cấy in vitro.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về vai trò của nano kim loại đến quá trình khử trùng bề mặt, sinh trưởng, phát triển, sự biến động khí ethylene và nâng cao chất lượng cây giống trong vi nhân giống cây hoa cảnh, cây ăn trái và cây dược liệu.

Luận án là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực vi nhân giống thực vật.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của luận án có nhiều tiềm năng ứng dụng trong sản xuất cây giống thương mại.

Những đóng góp mới của luận án

Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ứng dụng nano kim loại (AgNPs, FeNPs) trong vi nhân giống cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh.

Đề tài đã đánh giá được vai trò của AgNPs trong ức chế khí ethylene nhằm nâng cao chất lượng cây giống cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro.

Bổ sung nano kim loại vào môi trường nuôi cấy trong giai đoạn vi nhân giống đã giúp gia tăng khả năng thích nghi cũng như tỷ lệ sống của cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh ở giai đoạn vườn ươm.

Xây dựng được quy trình nhân giống của ba loại cây trồng có giá trị kinh tế cao là cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh dưới ảnh hưởng của nano kim loại.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

VI NHÂN GIỐNG

1.1.1. Khái niệm vi nhân giống

Vi nhân giống là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đường và chất làm đông. Trong mấy thập kỷ qua, vi nhân giống đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới, được ứng dụng trong sản xuất thương mại, đồng thời có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống cây quí hiếm hoặc phục tráng giống [19].

1.1.2. Các giai đoạn trong vi nhân giống thực vật

1.1.2.1. Khử trùng bề mặt

Khử trùng mẫu cấy là giai đoạn có nhiều tác nhân cần được kiểm soát như địa điểm thu nhận, độ sạch, khối lượng trung bình, độ tuổi khai thác và tình trạng sinh trưởng của cây. Mặc dù, khi đã kiểm soát được các tác nhân trên thì sự nhiễm nấm và khuẩn vẫn ảnh hưởng đến tỷ lệ thành công của giai đoạn này. Vì vậy, các phương pháp khác nhau đã được phát triển trong vài năm qua, có thể kể đến như cải tiến dụng cụ, hoặc sử dụng các hoá chất khử trùng. Street (1974) đã đưa ra các chất hoá học, nồng độ khử trùng và thời gian xử lý mẫu cấy để loại bỏ các yếu tố gây nhiễm được thể hiện trong Bảng 1.1. Như vậy, có thể thấy Ca(ClO)2, HgCl2 và kháng sinh là ba chất khử trùng được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô thực vật [150].

Ca(ClO)2 có tác dụng ức chế nấm mốc và vi khuẩn bằng cách ăn mòn thành tế bào hay tác động lên hệ enzyme của vi khuẩn. Vì vậy, nó được sử dụng như một chất để khử trùng khi đưa các nguồn mẫu ban đầu từ điều kiện ex vitro vào nuôi cấy in vitro. Mặt khác, các mô tế bào thực vật cũng bị tổn thương khi tiếp xúc với Ca(ClO)2; ngoài ra, sức khoẻ con người cũng bị ảnh hưởng khi nuốt hay hít phải Ca(ClO)2 [167].

HgCl2 là một dạng muối của thuỷ ngân, hiện được sử dụng phổ biến trong quy mô phòng thí nghiệm. Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, Hussanin và cộng sự (1994) đã thành công khi sử dụng HgCl2 như là một chất giúp chống lại các vi khuẩn và nấm

trong giai đoạn vào mẫu ban đầu [77]; nhưng muối thuỷ ngân này lại rất độc - có thể gây tổn thương não và gan khi con người tiếp xúc hay nuốt phải [167].

Về mặt lý thuyết, dường như tất cả các vấn đề nhiễm bẩn có thể được kiểm soát, nhưng sau một thời gian lại bùng phát trở lại. Trong hầu hết các trường hợp này chất kháng sinh được sử dụng để làm giảm vấn đề, nhưng các chất này thường gây độc tế bào hoặc có thể làm chậm, ức chế sự phát triển mô thực vật và xuất hiện hiện tượng vi sinh vật kháng chất kháng sinh [35], [147].

Trong những năm gần đây, việc sử dụng các hoá chất trên đã có một số thành công nhất định trong vi nhân giống thực vật. Đặc biệt, trên các đối tượng cây salem và dâu tây các nghiên cứu này thường tập trung vào ảnh hưởng của nguồn mẫu, chất khử trùng, nồng độ và thời gian xử lý lên quá trình khử trùng bề mặt (Bảng 1.2).

Bảng 1.1. Tác nhân khử trùng, nồng độ kết hợp với thời gian xử lý trong khử trùng mẫu cấy

Chất khử trùng

Nồng độ (g/L)	Thời gian (phút)
Ca(ClO)2	90 – 100	5 – 30
HgCl2	1 – 10	2 – 10
Sodium hypochlorite (NaOCl)	10 – 30	5 – 30
Nước oxy già (H2O2)	100 – 120	5 – 15
Nước brom (Br2)	10 – 20	2 – 10
Chất kháng sinh	0,004 – 0,05	30 – 60

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 195 trang tài liệu này.

Bảng 1.2. Một số nghiên cứu khử trùng bề mặt mẫu cấy trên cây salem và dâu tây

Loài thực vật Vật liệu Chất khử trùng

(nồng độ × thời gian)

Nguồn

Salem (Limonium sinuatum)

Chồi đỉnh HgCl2 (1 g/L × 5 phút) [83]

Dâu tây (Fragaria

× ananassa

Duch.)

Chồi đỉnh của ngó, đoạn thân bò mang chồi

HgCl2 (1 g/L × 4 phút) [79]

Dâu tây (Fragaria

× ananassa

Duch.)

Chồi đỉnh, đoạn thân bò mang chồi, cuống lá

NaOCl (5 g/L × 15 phút) [111]

Dâu tây (Fragaria

× ananassa

Duch.)

Đoạn thân bò mang chồi

Thuốc diệt nấm (10 mL/L × 2 giờ); ciprofloxacin (200 g/L × 1

giờ); Tween 20 (2 giọt × 5 phút);

cồn (70% × 5 phút); HgCl2 (1 g/L

× 5 phút)

[122]

Dâu tây (Fragaria

× ananassa Chandler, Osogrande, Islamabad Local)

Dâu tây (Fragaria

× ananassa

Chandler)

Đỉnh sinh trưởng

NaOCl (5 g/L × 15 phút) [111]

NaOCl (1 g/L × 15 phút) [111]

Dâu tây (Fragaria

× ananassa

Festivsl)

Dâu tây (Fragaria

× ananassa

Albion)

Lá non NaOCl (4 g/L × 20 phút) [21]

Lá non NaOCl (3 g/L × 20 phút) [21]

1.1.2.2. Phát sinh hình thái Cảm ứng mô sẹo

Cảm ứng mô sẹo là một trong những kỹ thuật cơ bản của vi nhân giống thực vật. Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hoá dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, chất điều hoà sinh trưởng thực vật). Các tế bào thuộc mô và cơ quan này phải trải qua quá trình phân hoá trước lần phân chia đầu tiên cho phép tế bào trở lại trạng thái “trẻ hoá” giúp tế bào tái lập khả năng phân chia trong các điều kiện thích hợp [70].

Nhìn chung, cảm ứng mô sẹo thông qua 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia và biệt hoá tế bào. Trong giai đoạn phát sinh mô sẹo, sự trao đổi các chất kích thích dẫn đến sự phân chia tế bào, độ dài của giai đoạn này phụ thuộc vào tình trạng

sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Vào giai đoạn tiếp theo của quá trình hình thành mô sẹo thì các tế bào phân chia tăng nhanh sinh khối. Sau đó, tế bào đi vào quá trình biệt hoá dẫn đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao. Mô sẹo khi hình thành thường gồm hai loại: (1) mô sẹo xốp - chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to; (2) mô sẹo cứng thì ngược lại - các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ [20].

Nuôi cấy mô sẹo xốp được ứng dụng rộng rãi trong vi nhân giống: (1) vi nhân giống ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện được; (2) làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, tế bào trần, phát sinh phôi, tái sinh chồi, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học; (3) làm nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: tế bào đột biến, chịu mặn, kháng sâu bệnh [20].

Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào là phương thức nuôi tế bào đơn hay cụm nhiều tế bào ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng. Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo ở môi trường lỏng chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy. Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng. Ở đó chúng sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào. Điều kiện quan trọng của nuôi cấy huyền phù tế bào là môi trường nuôi cấy được khuấy lắc liên tục với tốc độ 100 – 150 vòng/phút. Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mô sẹo và các tế bào chết. Sự tái sinh thực vật từ huyền phù tế bào là giai đoạn quan trọng cho phép thực hiện nhân giống in vitro ở mức độ công nghiệp, cũng như mọi thao tác ở mức độ tế bào [156].

Khi phát triển trong môi trường lỏng, các tế bào đơn của thực vật thường trải qua 4 giai đoạn: thích nghi, tăng trưởng, cân bằng và suy vong. Giai đoạn thích nghi là giai đoạn đầu tiên, nó kéo dài cho tới khi có tín hiệu phân chia đầu tiên. Ở giai đoạn này không xảy ra sự tăng khối lượng và số lượng tế bào. Giai đoạn này được xem là giai đoạn thích ứng của tế bào với môi trường nuôi cấy trước khi sự sinh trưởng của