Các muối vô cơ K2HPO4, MgSO4, NaCl và CaCl2 được sử dụng trong thí nghiệm dựa trên cơ sở từ nghiên cứu của các tác giả Peng và ctv (2014), Trần Quốc Tuấn và ctv (2014), Đoàn Thị Tuyết Lê và ctv (2020) đã chứng minh là nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng đến quá trình phát triển sinh khối vi sinh vật.
Bảng 2.1. Các biến trong ma trận Plackett – Burman của 2 chủng vi khuẩn
B.licheniformis B85 và P.stutzeri KL15.
Yếu tố | Ký hiệu | ||
Thấp (-1) | Cao (+1) | ||
Mật rỉ đường (g/L) | X1 | 2 | 6 |
Cao nấm men(g/L) | X2 | 9 | 25 |
K2HPO4 (g/L) | X3 | 1,25 | 5,00 |
MgSO4 (g/L) | X4 | 0,25 | 1,50 |
CaCl2 (g/L) | X5 | 0,05 | 0,40 |
NaCl (g/L) | X6 | 1 | 5 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Đặc Điểm Của Các Nhóm Vi Khuẩn Tham Gia Quá Trình Chuyển Hóa Nitơ -
Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Môi Trường Nước Nuôi Tôm Thẻ Chân Trắng -
Phân Lập Và Định Danh Vi Khuẩn Chuyển Hóa Ammonia (Aob) -
Các Phương Pháp Đánh Giá Chỉ Tiêu Chất Lượng Môi Trường Nước Và Vi Sinh Vật Sử Dụng Trong Thí Nghiệm. -
Kết Quả Phân Lập Vi Khuẩn Chuyển Hóa Ammonia (Aob) Từ Mẫu Bùn -
Kết Quả Phân Lập Vi Khuẩn Chuyển Hóa Nitrite Từ Mẫu Bùn
Xem toàn bộ 247 trang tài liệu này.
Thiết kế ma trận Plackett-Burman trình bày trong Bảng 2.2, Bảng 2.3. Các yếu tố được sàng lọc cho độ tin cậy cao (p<0,05) sẽ được đưa vào mô hình tối ưu hóa sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt theo phương án cấu trúc RSM – BBD (Plackett & Burman, 1946; Nguyễn Cảnh, 2004).
Bảng 2.2. Ma trận thiết kế Plackett – Burman của vi khuẩn B.licheniformis B85
Các biến | ||||||
thức | X1 | X2 | X3 | X4 | X5 | X6 |
1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 |
2 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 |
3 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
4 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 |
5 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
6 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 |
7 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 |
8 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 |
9 | -1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 |
10 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 |
11 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 |
12 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 |
Bảng 2.3. Ma trận thiết kế Plackett – Burman của vi khuẩn P. stutzeri KL15
Các biến | ||||||
thức | X1 | X2 | X3 | X4 | X5 | X6 |
1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 |
2 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 |
3 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 |
4 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 |
5 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
6 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 |
7 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
8 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 |
9 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 |
10 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 |
11 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 |
12 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 |
Vi khuẩn sau khi tăng sinh mật độ đạt 108 CFU/mL sẽ được cấy vào từng môi
trường có thành phần được bố trí theo ma trận Plackett - Burman với tỷ lệ nạp giống, nhiệt độ, pH, thời gian đã được xác định. Nhập mật độ vi khuẩn vào ma trận và xử lý bằng phần mềm Design Exprert 11, chọn ra 3 yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn.
Sàng lọc các yếu tố có ý nghĩa bằng thiết kế Plackett – Burman của vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9.
Bảng 2.4. Các biến trong ma trận Plackett - Burman của vi khuẩn R.rhodochrous T9.
Yếu tố | Ký hiệu | ||
Thấp (-1) | Cao (+1) | ||
Glucose (g/L) | X1 | 4 | 8 |
Pepton (g/L) | X2 | 6 | 10 |
K2HPO4 (g/L) | X3 | 1,25 | 5,00 |
MgSO4 (g/L) | X4 | 0,25 | 1,50 |
CaCl2 (g/L) | X5 | 0,05 | 0,40 |
NaCl (g/L) | X6 | 1 | 5 |
Các yếu tố được chọn cho nghiên cứu này là glucose, pepton, K2HPO4, MgSO4, NaCl và CaCl2 được liệt kê trong Bảng 2.4, thiết kế Plackett-Burman cho phép
đánh giá các yếu tố, mỗi yếu tố đã được kiểm tra ở hai cấp độ: mức thấp (-1) và mức cao (+1).
Bảng 2.5. Ma trận thiết kế Plackett – Burman của vi khuẩn R.rhodochrous T9
Các biến | ||||||
thức | X1 | X2 | X3 | X4 | X5 | X6 |
1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 |
2 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 |
3 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 |
4 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
5 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 |
6 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 |
7 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 |
8 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 |
9 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 |
10 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 |
11 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
12 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 |
Tối ưu hóa các thành phần môi trường lên men vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 và Pseudomonas stutzeri KL15 bằng thiết kế Box – Behnken.
Sử dụng phương pháp thiết kế Box - Behnken để tạo mô hình kiểm tra các biến cần thiết cho quá trình nhân sinh khối vi khuẩn. Trong thí nghiệm có ba mức độ khảo sát là thấp (-1), cơ sở (0) và cao (+1). Ba yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn được chọn lọc từ thiết kế ma trận Plackett-Burman sẽ được sử dụng trong ma trận Box - Behken (Bảng 2.6 và 3.7), được ký hiệu lần lượt là A (Mật rỉ đường), B (Cao nấm men), C (MgSO4), C’ (NaCl) (Box và Behnken, 1960). Bảng 2.6. Các yếu tố sử dụng trong Box – Behnken của Bacillus licheniformis B85
Ký | Đơn vị | Khoảng | Mức | |||
hiệu | biến thiên | Thấp (-1) | Cơ sở (0) | Cao (1) | ||
Mật rỉ đường | A | g/L | 2 - 6 | 2 | 4 | 6 |
Cao nấm men | B | g/L | 9 - 25 | 9 | 17 | 25 |
NaCl | C’ | g/L | 1 - 5 | 1 | 3 | 5 |
Bảng 2.7. Ma trận thí nghiệm Box – Behnken của Bacillus licheniformis B85
A | B | C’ | |
1 | 1 | 1 | 0 |
2 | 0 | 1 | -1 |
3 | 1 | 0 | 1 |
4 | 0 | -1 | 1 |
5 | 1 | -1 | 0 |
6 | -1 | 0 | -1 |
7 | 0 | 0 | 0 |
8 | 0 | -1 | -1 |
9 | 0 | 0 | 0 |
10 | 0 | 1 | 1 |
11 | -1 | -1 | 0 |
12 | 0 | 0 | 0 |
13 | -1 | 0 | -1 |
14 | 1 | 0 | -1 |
15 | -1 | 1 | 0 |
Bảng 2.8. Các yếu tố sử dụng trong Box –Behnken của Pseudomonas stutzeri KL15
Ký | Khoảng | Mức | ||||
Yếu tố | Đơn vị | |||||
hiệu | biến thiên | Thấp (-1) | Cơ sở (0) | Cao (1) | ||
Mật rỉ đường | A | g/L | 2 - 6 | 2 | 4 | 6 |
Cao nấm men | B | g/L | 9 - 25 | 9 | 17 | 25 |
MgSO4 | C | g/L | 0,5 – 1,5 | 0,5 | 1,0 | 1,5 |
Sau khi xác định mật độ vi khuẩn theo ma trận thí nghiệm Box – Behnken của 2 chủng vi khuẩn, nhập mật độ vi khuẩn vào ma trận trong phần mềm Design Expert 11, đọc kết quả ở mục Analysis gồm ANOVA, Diagostics, Model Graphs và mục Optimization để xác định phương trình hồi quy.
Bảng 2.9 Ma trận thí nghiệm Box – Behnken của Pseudomonas stutzeri KL15
A | B | C | |
1 | 1 | 0 | -1 |
2 | 0 | 0 | 0 |
3 | 1 | 1 | 0 |
4 | 0 | -1 | 1 |
5 | -1 | 0 | -1 |
6 | -1 | 0 | 1 |
7 | 0 | -1 | -1 |
8 | 0 | 0 | 0 |
9 | 0 | 1 | -1 |
0 | 0 | 0 | |
11 | 0 | 1 | 1 |
12 | 1 | 0 | 1 |
13 | -1 | 1 | 0 |
14 | 1 | -1 | 0 |
15 | -1 | -1 | 0 |
Hàm đáp ứng được chọn là mật độ vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 (Y1, CFU/mL), Pseudomonas stutzeri KL15 (Y2, CFU/mL). Từ đó xác định mật độ vi khuẩn đạt cao nhất ở các thông số tối ưu.
Phương trình hồi quy của môi trường lên men Bacillus licheniformis B85 có dạng:
Y1 = bo + b1A + b2B + b3C’ + b12AB + b13AC’ + b23BC’ + b11A2 + b22B2 + b33 C’2
Phương trình hồi quy của môi trường lên men Pseudomonas stutzeri KL15 có dạng:
Y2 = bo + b1A + b2B + b3C’ + b12AB + b13AC + b23BC + b11A2 + b22B2 + b33 C2
Trong đó: bo là hệ số hồi quy tại tâm; b1, b2, b3 là hệ số tuyến tính
b12, b13, b23 là hệ số tương tác; b11, b22, b33 la hệ số bình phương A, B và C, C’ là các biến độc lập.
Tối ưu hóa các thành phần môi trường lên men vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 bằng thiết kế Box – Behnken
Sử dụng phương pháp thiết kế Box - Behnken để tạo mô hình kiểm tra các biến cần thiết cho quá trình nhân sinh khối vi khuẩn. Trong thí nghiệm có ba mức độ khảo sát là thấp (-1), cơ sở (0) và cao (+1). Ba yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn được chọn lọc ở ma trận Plackett-Burman sẽ được sử dụng trong ma trận Box – Behken (Bảng 2.10 và 3.11), được ký hiệu là A’ (Glucose), B’ (Cao nấm men), C’ (NaCl) (Box và Behnken, 1960).
Bảng 2.10. Các yếu tố sử dụng trong Box – Behnken của R.rhodochrous T9.
Ký | Khoảng | Mức | ||||
Yếu tố | Đơn vị | |||||
hiệu | biến thiên | Thấp (-1) | Cơ sở (0) | Cao (1) | ||
Glucose | A’ | g/L | 4 - 8 | 4 | 6 | 8 |
Pepton | B’ | g/L | 6 - 10 | 6 | 8 | 10 |
NaCl | C’ | g/L | 1 - 5 | 1 | 3 | 5 |
Nhập mật độ vi khuẩn vào ma trận Box – Behken ở Bảng 2.11 được tạo từ phần mềm Design Expert 11, đọc kết quả ở mục Analysis gồm ANOVA, Diagostics, Model Graphs và mục Optimization để xác định phương trình hồi quy. Bảng 2.11. Ma trận thí nghiệm Box – Behnken của Rhodococcus rhodochrous T9
A’ | B’ | C’ | |
1 | 0 | 0 | 0 |
2 | 1 | 0 | 1 |
3 | 1 | 1 | 0 |
4 | 0 | -1 | 1 |
5 | 0 | -1 | -1 |
6 | -1 | -1 | 0 |
7 | -1 | 1 | 0 |
8 | 0 | 1 | -1 |
9 | -1 | 0 | -1 |
10 | 0 | 0 | 0 |
11 | 0 | 0 | 0 |
12 | 0 | 1 | 1 |
13 | 1 | 0 | -1 |
14 | -1 | 0 | 1 |
15 | 1 | -1 | 0 |
Hàm đáp ứng được chọn là mật độ vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 (Y3,CFU/mL). Từ đó xác định mật độ vi khuẩn đạt cao nhất ở các thông số tối ưu. Phương trình hồi quy có dạng: Y3 = bo + b1A’ + b2B’ + b3C’ + b12A’B’ + b13A’C’
+ b23B’C’ + b11A’2 + b22B’2 + b33 C’2
Trong đó: bo là hệ số hồi quy tại tâm; b12, b13, b23 là hệ số tương tác
b12, b13, b23 là hệ số tương tác; b11, b22, b33 la hệ số bình phương A’, B’, C’ là các biến độc lập.
2.5.2. Chế tạo chế phẩm vi sinh dạng bột
2.5.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sản xuất của các chủng vi khuẩn trên môi trường bán rắn
Khảo sát môi trường ảnh hưởng đến sinh khối các chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn sau khi được tối ưu hóa trên môi trường TSB sản xuất sẽ được nhân lên theo đề xuất của mô hình. Sau đó tiến hành chuyển dịch vi khuẩn lỏng vào môi trường bán rắn có chứa cám gạo, cám bắp, cám lúa mì, bã đậu nành và
các chất khoáng (phụ lục 2.4) đã tiệt trùng với tỷ lệ nạp giống 5% (có mật độ 108 CFU/mL) vào các môi trường với độ ẩm 50%, nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ nuôi cấy, đếm mật độ vi khuẩn, lựa chọn môi trường tốt nhất cho từng chủng vi khuẩn.
Khảo sát tỷ lệ nạp giống ảnh hưởng đến mật độ các chủng vi khuẩn
Sau khi đã chọn được thành phần môi trường bán rắn phù hợp cho từng chủng vi khuẩn, khảo sát tỷ lệ nạp giống vi khuẩn là 2,5%, 5%, 7,5% và 10% (mật độ vi khuẩn 108 CFU/mL), ủ ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ để chọn ra tỷ lệ nạp giống tốt nhất.
Khảo sát độ ẩm ảnh hưởng đến mật độ các chủng vi khuẩn
Sau khi chọn được môi trường bán rắn, tỷ lệ nạp giống phù hợp cho từng chủng vi khuẩn, tiến hành khảo sát độ ẩm nuôi cấy các chủng vi khuẩn là 45%, 50%, 55%, 60%, ủ ở nhiệt độ 30oC sau 48 giờ, đếm mật số vi khuẩn để chọn độ ẩm tốt nhất.
Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến mật độ các chủng vi khuẩn
Sau khi chọn được môi trường bán rắn và tỷ lệ nạp giống, độ ẩm phù hợp thì thực hiện thí nghiệm để khảo sát thời gian nuôi cấy với mốc thời gian 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ, ở nhiệt độ 30oC. Đếm mật độ vi khuẩn để chọn thời gian tối ưu.
2.5.2.2. Bảo quản chế phẩm vi sinh dạng bột
Chế phẩm vi sinh được khảo sát ở 2 mức nhiệt độ: nhiệt độ phòng (28 - 32o C), nhiệt độ tủ mát (4 - 8oC) trong thời gian bảo quản là 30, 60, 90, 120, 180, 270, 360 ngày, sau mỗi mức thời gian tiến hành đếm mật độ vi khuẩn.
2.6. Nội dung 3: Đánh giá chuyển hóa nitơ của các chủng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản.
2.6.1. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng ở qui mô phòng thí nghiệm
Mẫu nước (độ mặn lúc thu nước là 21o%) của ao nuôi tôm thẻ chân trắng được 1,5 tháng (không có tôm thí nghiệm) được vận chuyển về PTN vào buổi chiều tối và được thực hiện ngay vào buổi sáng hôm sau. Bổ sung các tỷ lệ chế phẩm vi sinh vật có tổng mật độ vi khuẩn 108 CFU/gam (Supono và ctv, 2019; Jefri và ctv, 2020) vào các can 20L(chứa 20L nước), theo dõi các chỉ tiêu pH, ammonia, nitrite, nitrate,
tổng vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn chuyển hóa ammonia, vi khuẩn chuyển hóa nitrite theo từng ngày, trong thời gian 5 - 6 ngày nhằm đánh giá hiệu quả chuyển hóa Nitơ của các chế phẩm vi sinh và khảo sát được tỷ lệ bổ sung vi khuẩn vào nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng. Thí nghiệm có sục khí ở tất cả các bình, mỗi bình chứa 20 lít nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng có dư lượng ammonia, nitrite với các nghiệm thức như sau:
V = 20 lít
Theo dõi
NT
NT
NT
NT
NT
ĐC
các chỉ tiêu TAN, NO2
-
, pH, NO -
3 ,
Vi sinh vật qua từng ngày
Nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng
Bổ sung chế phẩm vi sinh bao gồm 3 vi khuẩn theo tỷ lệ 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5%
Tất cả các can được sụt khí 24/24, nhiệt độ phòng tương đối 30⁰C
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ĐC: không bổ sung dịch khuẩn.
NT1: bổ sung 20 gam chế phẩm vi sinh đã phối trộn ở mật độ 108 (CFU/g). NT2: bổ sung 40 gam chế phẩm vi sinh đã phối trộn ở mật độ 108 (CFU/g). NT3: bổ sung 60 gam chế phẩm vi sinh đã phối trộn ở mật độ 108 (CFU/g). NT4: bổ sung 80 gam chế phẩm vi sinh đã phối trộn ở mật độ 108 (CFU/g). NT5: bổ sung 100 gam chế phẩm vi sinh đã phối trộn ở mật độ 108 (CFU/g).
2.6.2. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nuôi tôm thẻ chân trắng giai đoạn ương giống ở qui mô bể xi-măng 1m3
Chuẩn bị tôm thí nghiệm
Tôm được mua từ công ty TNHH sản xuất giống Thủy Sản Châu Mỹ, Khánh Hội, xã Tri Hải, Ninh Hải, Tỉnh Ninh Thuận và đã được kiểm tra các bệnh do vi rút đốm trắng (WSSV), đầu vàng (YHV), bệnh gan tụy (HPV), hội chứng Taura (TSV) bằng phương pháp RT- PCR. Nước nuôi được tiến hành kiểm tra độ mặn trong các bể dưỡng nhằm đảm bảo độ mặn thích hợp với độ mặn thuần tôm giống trước khi