Nghiên cứu tạo phức hợp bao của B-Cyclodextrin với một số Polyphenol định hướng ứng dụng trong y sinh

Hình 2.6: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng 44

Hình 2.7: Khoảng chuyển dịch hóa học của một số proton 45

Hình 2.8: Khoảng chuyển dịch hóa học các dạng carbon chọn lọc. 46

Hình 3.1: Sắc ký bản mỏng đối chứng rutin (a) và quercetin (b) (A: rutin thu được từ nghiên cứu; B: rutin đối chứng; 1: quercetin thu được từ nghiên cứu;

2: quercetin đối chứng)… 51

Hình 3.2: Sắc ký khảo sát quá trình thủy phân rutin trong HCl 5% 52

Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của quercetin 53

Hình 3.4: Phổ 13C-NMR của quercetin 54

Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của rutin 56

Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của rutin 57

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 86 trang tài liệu này.

Hình 3.7: Phổ HPLC mẫu rutin tinh chế trong axit acetic ( a: nồng độ axit acetic 20%; b: nồng độ axit acetic 30%; c: nồng độ axit acetic 40%; d: nồng độ axit acetic 50%). 58

Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của rutin (a), phức chất [RuβCD](b) và βCD(c). 62

Hình 3.9: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier của Quer (1), HPβCD (2) và phức hợp [QuerHPβCD] 64

Hình 3.10: Các đường cong DSC của rutin (a); phức chất nano rutin (b) và β-CD (c). 66

Hình 3.11:Các đường cong DSC của Quer (1), HPβCD (2) và phức hợp (3....)67

Hình 3.12: Ảnh FESEM của các hạt RuT (a), Quer (b), [RuTβCD] (c) và [QuerHPβCD] (d). 68

Hình 3.13: Phổ UV-Vis của quercetin khi không có HPβCD (đường cong a)

và khi có HPβCD với nồng độ tăng dần (đường cong 1-5). 70

Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ của cyclodextrin và

độ tan của RuT (a) và Quer (b). 71

Hình 3.15: Phần trăm hòa tan của RuT và phức [RuT-βCD] theo thời gian trong môi trường pH 7,4 72

Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa % bắt gốc tự do DPPH của rutin và phức [RuT-HPβCD] theo giá trị nồng độ của rutin 73

MỞ ĐẦU

Hiện nay, việc nghiên cứu và bào chế dược phẩm từ các nguồn nguyên liệu thiên nhiên đang là hướng nghiên cứu hấp dẫn bởi tính ưu việt, đa dạng và ít tác dụng phụ. Flavonoid là nhóm chất phổ biến trong thực vật, có mặt trong hầu hết các bộ phận của các loài thực vật bậc cao và có nhiều tác dụng sinh học. Rutin và quercetin là hai trong số rất nhiều hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh nhờ những hoạt tính quý báu như hoạt tính chống oxi hóa, chống dị ứng, kháng viêm, chống ung thư và khối u. Tuy nhiên, rutin và quercetin lại kém tan trong nước, do đó, liều lượng cần để đưa vào cơ thể khá lớn, độc tính cao, nhưng sinh khả dụng lại không đủ. Hiện nay, với việc ứng dụng công nghệ nano trong ngành sản xuất dược phẩm, độ tan của nhiều dược chất đã được cải thiện đáng kể. Trong đó, cyclodextrin được biết đến với khả năng bao gói giúp độ tan của nhiều loại dược chất được tăng lên rò rệt.

Do đó, trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu tạo phức hợp bao của β- cyclodextrin với một số polyphenol định hướng ứng dụng trong y sinh” rutin sẽ được chiết xuất và tinh chế từ hoa hòe có hàm lượng và hiệu suất cao; sau đó quercetin sẽ được bán tổng hợp từ rutin bằng phương pháp thủy phân trong môi trường axit; quá trình tạo phức với cyclodextrin để làm tăng độ tan của dược chất sẽ được tiến hành. Sản phẩm của quá trình tạo phức sẽ được phân tích đặc trưng bằng một số phương pháp hóa-lý hiện đại, đồng thời hoạt tính chống oxi của các hoạt chất sẽ được khảo sát.

Mục tiêu của đề tài

- Chiết xuất và tinh chế thành công rutin từ hoa hòe có hàm lượng cao.

- Bán tổng hợp thành công quercetin từ rutin bằng phương pháp thủy phân trong môi trường acid.

- Tổng hợp thành công phức chất rutin/β-cyclodextrin, quercetin/2- hydroxypropyl-β-cyclodextrin với kích thước nano có độ tan cao hơn độ tan của rutin và quercetin thuần.

Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất rutin từ hoa hòe sử dụng dung dịch kiềm loãng Na2CO3 2%.

- Tinh chế rutin bằng hai phương pháp: phương pháp kết tinh trong cồn và phương pháp kết tủa bằng acid-base.

- Bán tổng hợp quercetin từ rutin trong môi trường axit.

- Tổng hợp phức hợp của rutin và quercetin với cyclodextrin có kích thước nanomet.

- Đặc trưng sản phẩm tạo phức, xác định độ tan của dược chất bằng các phương pháp hóa–lý hiện đại: FTIR, DSC, SEM, DLS, UV-Vis…

- Xác định hoạt tính chống oxi hóa của rutin và quercetin trước và sau khi tạo phức bằng phương pháp bắt gốc tự do DPPH.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn lựa các điều kiện thích hợp để cải thiện độ tan của một số flavonoid trong nhóm quercetin bằng phương pháp tạo phức hợp bao với cyclodextrin; là cơ sở cho việc nghiên cứu hoàn thiện và phát triển sản phẩm rutin, quercetin bao gói bằng cyclodextrin ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Bên cạnh đó, các kết quả nghiên cứu sẽ được sử dụng trong các bài giảng và phòng thí nghiệm trong các khóa học dành cho cử nhân và thạc sĩ chuyên ngành "Hóa lý và hóa lý thuyết", và “hóa hữu cơ”.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. KHÁI QUÁT VỀ NHÓM FLAVONOID VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC

1.1.1. Khái niệm chung về nhóm flavonoid

Flavonoid là nhóm chất phổ biến trong thực vật, có mặt trong hầu hết các bộ phận của các loài thực vật bậc cao và có nhiều tác dụng sinh học. Có thể mô tả khung công thức phân tử của flavonoid là: C6 (vị trí A) - C3 (vị trí C) - C6 (vị trí B), chúng còn được gọi là polyphenolic do các tiểu phần có cấu trúc từ vòng thơm benzen (hình 1.1). Flavonoid được ví von như “những người thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống dị ứng, virus và các chất gây ra ung thư. Nhờ vậy chúng mang lại những hoạt tính quý báu. Có thể nói hoạt tính chống oxi hóa là hoạt tính đặc trưng nhất của các hợp chất flavonoid nhờ vào các đặc điểm cấu trúc phân tử như sau [1]:

- Chứa các nhóm hydroxy liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp các flavonoid có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do.

- Chứa các vòng thơm (vòng benzen, vòng dị nguyên tố) và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp bền hóa các gốc tự do được hình thành khi chúng bắt giữ các phần tử oxi hoạt động.

- Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động.

Hình 1.1: Khung cấu tạo phân tử flavonoid.

Các flavonoid có thể được chia nhỏ thành các phân nhóm khác nhau tùy thuộc vào vị trí cacbon của vòng C mà vòng B gắn vào cùng mức độ không bão hòa và oxy hóa của vòng C (hình 1.2). Các flavonoid có vòng B được liên kết ở vị trí C-3 của vòng C được gọi là isoflavone. Những chất trong đó vòng B được liên kết ở vị trí C-4 được gọi là neoflavonoid, trong khi những chất trong đó vòng B được liên kết ở vị trí C-2 có thể được chia nhỏ hơn nữa thành nhiều nhóm con trên cơ sở đặc điểm cấu trúc của vòng C. Các phân nhóm này là: flavon, flavonols, flavanones, flavanonol, flavanols hoặc catechin, anthocyanins và chalcones [2].

Hình 1.2: Phân loại các flavonoid.

1.1.2. Đặc điểm cấu tạo phân tử của nhóm chất quercetin

Quercetin được phân loại là flavonol, một trong sáu phân lớp của các hợp chất flavonoid. Theo IUPAC, công thức phân tử quercetin là 3,3',4',5,7- pentahydroxyflavanone (hoặc 3,3',4',5,7-pentahydroxy-2-phenylchromen-4-one). Trong cấu tạo, quercetin có 5 nhóm OH gắn ở các vị trí 3, 5, 7, 3’ và 4’ (hình 1.3)

[3].

Hình 1.3: Cấu tạo phân tử quercetin.

Quercetin là một aglycone, không gắn thêm gốc đường. Quercetin có màu vàng, hoàn toàn không hòa tan trong nước lạnh, hòa tan kém trong nước nóng, nhưng hòa tan khá tốt trong rượu và lipid. Một glycoside quercetin được hình thành bằng cách gắn một nhóm glycosyl (đường như glucose, rhamnose, hoặc rutinose) để thay thế cho một trong các nhóm OH (thường ở vị trí C-3). Nhóm glycosyl kèm theo có thể thay đổi độ hòa tan, hấp thụ. Theo nguyên tắc chung, sự hiện diện của nhóm glycosyl (quercetin glycoside) làm tăng khả năng hòa tan trong nước so với quercetin aglycone [4]. Một số dẫn xuất quercetin cũng chứa disaccharide, chẳng hạn như rutinose, bao gồm rhamnose và nhóm glucose và được đặt tên là α-L- rhamnopyranosyl- (1→6)- β-D-glucopyranose. Avicularin chứa arabinofuranose gắn với quercetin 3-OH. Hyperoside có nhóm 3-O-galactoside (oxy liên kết với nhóm galactoside) ở vị trí C-3 chứ không phải là nhóm OH. Isoquercitin (được tìm thấy trong xoài) có 3-O-glucoside [5].

Hình 1.4: Cấu tạo phân tử rutin.

Rutin (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone-3-rhamnoglucoside) là một loại flavonoid thuộc nhóm flavon được phân lập lần đầu tiền vào năm 1842 từ cây Cửu lý hương (Ruta graveolen) bởi Veyss [6].

Rutin cũng được coi là một loại vitamin P dạng glycoside chính (một dạng 3- Orhamnoglucoside) của quercetin (hình 1.4). Bột rutin còn có đặc điểm là bột kết tinh màu vàng hoặc hơi vàng ánh xanh, để ngoài ánh sáng màu có thể hơi sẫm lại. Tinh thể rutin ngậm 3 phân tử nước, chuyển sang dạng khan khi sấy 12 giờ ở 100°C dưới áp suất giảm (10mmHg). Do cấu trúc là một glycoside nên rutin rất dễ bị thủy phân bởi các men có sẵn trong dược liệu hoặc bởi các axit. Với dung dịch kiềm nó rất ít bị ảnh hưởng, chỉ ở điều kiện dung dịch kiềm đặc và có nhiệt độ cao thì cấu trúc của rutin bị phá vỡ, cụ thể là vòng C sẽ mở tạo thành một dẫn chất acid thơm và một dẫn chất phenol [6].

1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của quercetin và rutin

Quercetin là một trong những bioflavonoid quan trọng có trong hơn 20 loại thực vật, được biết đến với tác dụng chống viêm, hạ huyết áp, giãn mạch, chống vi khuẩn và chống tăng cholesterol máu. Một số tác dụng có lợi khác bao gồm bảo vệ tim mạch, chống ung thư và khối u, chống loét, chống dị ứng, chống tiểu đường, tác dụng bảo vệ dạ dày, hạ huyết áp, điều hòa miễn dịch và chống nhiễm trùng. Người ta cũng phát hiện ra rằng quercetin và các chất chuyển hóa liên hợp của quercetin có thể bảo vệ hồng cầu khỏi tổn thương màng do hút thuốc gây ra [7], [8].

Quercetin kết hợp với axit ascorbic làm giảm tỷ lệ tổn thương do oxy hóa đối với các tế bào lympho và cấu trúc mạch thần kinh trên da và ức chế tổn thương tế bào thần kinh. Nó được biết là có tác dụng bảo vệ tế bào não chống lại oxy hóa, tác nhân làm tổn thương mô dẫn đến bệnh Alzheimer và các bệnh thần kinh khác [9].

Quercetin có đặc tính chống ung thư mạnh và được biết đến như là chất cảm ứng apoptosis, nhờ đó làm giảm sự phát triển của khối u trong não, gan, ruột kết và các mô khác và ức chế sự lây lan của các tế bào ác tính. Quercetin ức chế Cr[VI],

một biến đổi tế bào gây ung thư hóa học làm giảm khả năng hiển thị của tế bào, tạo ROS và tăng MicroRNA-21 (miR-21) trong ung thư ruột kết ở người [10], [11].

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng quercetin ức chế tiết axit dạ dày và quá trình peroxy hóa lipid của tế bào dạ dày do đó đóng vai trò như chất bảo vệ dạ dày. Nó cũng ức chế sự lây nhiễm Helicobacter pylori [7].

Quercetin được biết là có tác dụng kháng khuẩn đối với hầu hết các chủng vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa, hô hấp, tiết niệu và da. Khả năng chống nhiễm trùng và chống tái phát của chúng có thể góp phần vào các đặc tính kháng vi-rút. Các loại virus thường phản ứng với quercetin là adenovirus, virus herpes simplex, virus viêm não Nhật Bản và virus hợp bào hô hấp [12], [13], [14].

Quercetin có tác dụng chống dị ứng bằng cách ức chế giải phóng histamine từ các tế bào mast và các chất dị ứng khác, do đó hoạt động như một chất kháng histamine tự nhiên. Khả năng ngăn ngừa các tác động dị ứng của quercetin có ý nghĩa to lớn trong việc điều trị và phòng ngừa bệnh hen suyễn và viêm phế quản [15].

Tương tự quercetin, rutin cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong y học hiện đại. Rutin có tác dụng làm bền vững thành mạch, làm giảm tính thấm của mao mạch, tăng sự bền vững của hồng cầu. Rutin có hoạt tính của vitamin P bởi vì cấu trúc có 2 nhóm OH phenolic tự do. Rutin thể hiện hoạt tính chống đái tháo đường bằng cách ức chế các cytokine gây viêm, đồng thời cải thiện khả năng chống oxy hóa và lipid huyết tương trong chế độ ăn nhiều chất béo của người bệnh tiểu đường týp 2 do streptozotocin gây ra. Do đó, rutin hữu ích trong điều trị bệnh tiểu đường cùng với các loại thuốc trị tiểu đường tiêu chuẩn [16].

Rutin có thể đóng vai trò như một tác nhân tiềm năng để kiểm soát đường huyết thông qua việc tăng cường hoạt động kinase của thụ thể phụ thuộc insulin, từ đó tạo ra đường truyền tín hiệu insulin và làm tăng chuyển vị của chất vận chuyển glucose 4 và tăng hấp thu glucose [17].

Rutin bảo vệ chống lại các tác động thoái hóa thần kinh của sự tích tụ prion bằng cách tăng sản xuất các yếu tố hướng thần kinh và ức chế sự kích hoạt