Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu Piper nigrum L. tại Tây Nguyên

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Diện tích, sản lượng hồ tiêu của Việt Nam từ năm 2010-2019 6

Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lượng hồ tiêu một số vùng chính ở Việt Nam 7 Bảng 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn các chủng vi khuẩn vùng rễ có tiềm năng kháng Phytophthora capsici 42

Bảng 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng kháng nấm Fusarium trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm 44

Bảng 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng kháng tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu con trong điều kiện vườn ươm

...................................................................................................................................47

Bảng 2.4. Thành phần của môi trường nuôi cấy vi khuẩn 51

Bảng 2.5. Chương trình pha động trên cột C18 56

Bảng 3.1. Hiệu suất đối kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại 3 tỉnh Tây Nguyên 66

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 224 trang tài liệu này.

Bảng 3.2. Hiệu quả kháng Phytophthora capsici trên đoạn thân hồ tiêu 68

Bảng 3.3. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với nấm Fusarium

trong điều kiện in vitro 69

Bảng 3.4. Khả năng kháng nấm Fusarium sp. trên đoạn thân hồ tiêu của 06 chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu 71

Bảng 3.5. Tỷ lệ tử vong tuyến trùng của 43 chủng vi khuẩn vùng rễ 73

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến sinh trưởng thân, lá của cây hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora capsici 75

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến sinh trưởng rễ của cây hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora 76

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn vùng rễ đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và kháng bệnh của cây hồ tiêu vườn ươm sau 90 ngày lây nhiễm Phytophthora 77

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến sinh trưởng thân và lá của cây hồ tiêu vườn ươm 80

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến sinh trưởng rễ và mật độ vi sinh vật tổng số trong đất của cây hồ tiêu vườn ươm 81

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến một số chỉ tiêu sinh trưởng và kháng bệnh của cây hồ tiêu sau 120 ngày lây nhiễm nấm Fusarium 84

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến sinh trưởng thân và lá của cây hồ tiêu vườn ươm 85

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến rễ của cây hồ tiêu 87

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến một số chỉ tiêu bệnh trên cây hồ tiêu trong vườn ươm 88

Bảng 3.15. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của các chủng có hoạt tính kháng nấm và tuyến trùng cao 92

Bảng 3.16. Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA các chủng có hoạt tính kháng nấm và tuyến trùng cao 93

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng RB.DS29

...................................................................................................................................98

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của chủng RB.CJ41 và RB.EK7 99

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 100

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn RB.DS29

.................................................................................................................................101

Bảng 3.21. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 103

Bảng 3.22. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh trưởng của chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 104

Bảng 3.23. Khả năng ức chế nấm bệnh của các dịch nuôi cấy chủng RB.DS29 106

Bảng 3.24. Các hợp chất thứ cấp kháng Phytophthora của của chủng RB.DS29 bằng phân tích GC-MS 108

Bảng 3.25. Phân tích LC- MS các hợp chất kháng Phytophthora của chủng RB.DS29

.................................................................................................................................109

Bảng 3.26. Khả năng ức chế nấm bệnh của các dịch nuôi cấy chủng RB.CJ41 110

Bảng 3.27. Kết quả phân tích GC-MS của chủng Bacillus subtilis RB.CJ41 chứa 8 chất có các đỉnh (peak) rõ 113

Bảng 3.28. Kết quả phân tích LC-MS của chủng Bacillus subtilis RB.CJ41 114

Bảng 3.29. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng RB.EK7 đến tỷ lệ tử vong (%) tuyến trùng Meloidogyne sp. 115

Bảng 3.30. Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy chủng RB.EK7 đến tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. 117

Bảng 3.31 Kết quả phân tích GC-MS các hợp chất hoá học do chủng vi khuẩn RB.EK7 tổng hợp 119

Bảng 3.32 Khả năng ức chế tuyến trùng Meloidogyne sp. của cao chiết phân đoạn

.................................................................................................................................121

Bảng 3.33. Ảnh hưởng của dẫn xuất của Uracil đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng 123

Bảng 3.34. Ảnh hưởng của dẫn xuất của Thymine đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng 123

Bảng 3.35. Ảnh hưởng của hexahydropyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione đến tỷ lệ tử vong của tuyến trùng và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng 124

Bảng 3.37. Hiệu suất đối kháng (%) nấm Fusarium sp. của dẫn xuất của Uracil, dẫn xuất của Thymine và hexahydropyrrolo [1,2-a] pyrazine-1,4-dione 125

Bảng 3.38. Ảnh hưởng của chất mang đến mật độ chủng RB.DS29 126

Bảng 3.39. Ảnh hưởng của chất mang đến khả năng kháng nấm của vi khuẩn Bacillus velezensis RB.DS29 128

Bảng 3.40. Ảnh hưởng của chất mang đến mật độ chủng RB.CJ41 129

Bảng 3.41. Ảnh hưởng của chất mang đến hiệu suất đối kháng (%) nấm Fusarium oxysporum của vi khuẩn Bacillus subtilis RB.CJ41 130

Bảng 3.43. Ảnh hưởng của chất mang đến hoạt tính kháng tuyến trùng trong in vitro

của chế phẩm chứa chủng RB.EK7 132

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 1.1. Vòng đời của Phytophthora capsici và tác nhân gây hại [37] 10

Hình 1.2. Bào tử hậu của các loài Fusarium [45], [50] 14

Hình 1.3. Bào tử đính lớn [53] 15

Hình 1.4. Sự hình thành và các loại bào tử đính nhỏ do các loài Fusarium tạo ra ...16 Hình 1.5. Chu kỳ sống của tuyến trùng sần rễ [64] 18

Hình 2.1. Thông số thiết bị MS/MS dùng để nhận danh 57

Hình 2.2 Quy trình điều chế cao chiết 59

Hình 2.3. Quy trình phân tách các hợp chất VK01, VK02, VK03 và VK05 60

Hình 2.4. Quy trình phân tách thu nhận hợp chất VK04 62

Hình 3.1 Khả năng kháng Phytophthora của một số chủng vi khuẩn sau 7 ngày 65

Hình 3.2. Tác động của vi khuẩn vùng rễ đến hệ sợi Phytophthora 67

Hình 3.3 Chiều dài của đoạn thân hồ tiêu sau 4 ngày lây nhiễm Phytophthora 68

Hình 3.4. Khả năng đối kháng nấm bệnh Fusarium của 6 chủng vi khuẩn vùng rễ.70 Hình 3.5. Khả năng kháng nấm Fusarium sp. của 06 chủng vi khuẩn vùng rễ trên đoạn thân hồ tiêu 71

Hình 3.6. Chiều cao cây hồ tiêu sau 90 ngày lây nhiễm với nấm bệnh 78

Hình 3.7. Chiều cao cây và chiều dài rễ của cây hồ tiêu vườn ươm 82

Hình 3.8 Mật độ vi sinh vật tổng số trong đất hồ tiêu ở các nghiệm thức 83

Hình 3.9. Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn đến mật độ VSV tổng số 91

Hình 3.10. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của 3 chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 93

Hình 3.11. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng RB.DS29 với các chủng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI 94

Hình 3.12. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng RB.CJ41 với các chủng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI 94

Hình 3.13. Kết quả so sánh mức độ tương đồng của chủng RB.CJ41 với các chủng vi khuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI 95

Hình 3.14. Cây phân loại thể hệ mối liên quan giữa chủng RB.DS29, RB.CJ41 và RB.EK7 với các loài gần gũi dựa trên trình tự 16S rRNA 96

Hình 3.15. Mối tương quan giữa hoạt tính enzyme và hoạt tính kháng Phytophthora

.................................................................................................................................107

Hình 3.16. Mối tương quan giữa hoạt tính enzyme và hoạt tính kháng Fusarium.111 Hình 3.17. Hệ sợi nấm Fusarium dưới tác động của dịch nuôi cấy vi khuẩn RB.CJ41khi bổ sung bào tử nấm Fusarium sp. 112

Hình 3.18. Mối tương quan giữa hoạt tính enzyme và tỷ lệ tử vong tuyến trùng...116 Hình 3.19. Tác động của enzyme ngoại bào của vi khuẩn vùng rễ đến quá trình nở của trứng tuyến trùng và gây chết tuyến trùng trưởng thành 118

Hình 3.20. Sắc ký lớp mỏng các hợp chất phân tách 122

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Hồ tiêu (Piper nigrum L.) là cây công nghiệp có giá trị kinh tế và xuất khẩu cao của Việt Nam. Sản lượng hạt tiêu của Việt Nam chiếm tới 40% tổng sản lượng hạt tiêu toàn cầu. Theo quy hoạch đến năm 2020, tầm nhìn đến 2025, diện tích hồ tiêu của cả nước là 50.000 ha, nhưng chỉ trong vài năm gần đây, riêng Tây Nguyên đã có tới gần 93.000 ha, nâng tổng diện tích hồ tiêu cả nước lên 150.000 ha. Năm 2020, xuất khẩu hạt tiêu ước đạt 288 nghìn tấn, trị giá 665 triệu USD, tăng 1,2% về lượng, nhưng giảm 6,8% về trị giá so với cùng kỳ năm 2019 [1]. Trong những năm gần đây, trước tình trạng diện tích hồ tiêu phát triển quá nhanh, nhiều vườn hồ tiêu được đầu tư thâm canh cao độ, dịch bệnh được xem là yếu tố quan trọng hàng đầu dẫn đến việc nhiều vườn tiêu bị phá hủy. Hiện tượng hồ tiêu chết hàng loạt ở nhiều vùng trên cả nước đặc biệt là Tây Nguyên đã ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển bền vững của ngành hồ tiêu Việt Nam. Theo số liệu thống kê, diện tích hồ tiêu đạt cao điểm vào năm 2017 là 151.982 ha, sau đó giảm dần qua từng năm 2018 và 2019 còn 140.000 ha, giảm 11.900 ha qua hai năm do dịch bệnh. Nguyên nhân diện tích giảm do dịch bệnh chủ yếu là bệnh chết nhanh và bệnh vàng lá chết chậm. Bệnh chết nhanh do Phytophthora capsici và bệnh vàng lá chết chậm do tuyến trùng ký sinh thực vật Meloidogyne kết hợp với nấm Fusarium sp. được xem là bệnh rễ phổ biến và nghiêm trọng nhất trên cây hồ tiêu hiện nay [2-8].

Ba biện pháp được sử dụng nhiều nhất trong quản lý bệnh chết nhanh và chết chậm trên cây hồ tiêu gồm sử dụng các giống kháng, luân canh cây trồng và dùng các thuốc hóa học để diệt nấm [9-11]. Tuy nhiên, việc sử dụng các thuốc hoá học diệt nấm sẽ gây ô nhiễm môi trường, giảm chất lượng sản phẩm, đa dạng vi sinh vật và tăng sự đề kháng của tác nhân lây bệnh [12]. Gần đây, các nghiên cứu sử dụng các tác nhân kiểm soát sinh học thân thiện với môi trường đang được ưu tiên hàng đầu trong các chương trình quản lý dịch hại tổng hợp nhằm thay thế cho hóa chất nông nghiệp. Các tác nhân kiểm soát sinh học như nấm đối kháng, vi khuẩn nội sinh, vùng rễ kháng nấm bệnh, tuyến trùng và kích thích sinh trưởng bộ rễ [13-14]. Trong đó, vi khuẩn vùng rễ (Rhizobacteria) kháng nấm bệnh, tuyến trùng và thúc đẩy sinh trưởng thực vật đang được nhiều nghiên cứu quan tâm [15-17]. Vi khuẩn vùng rễ cạnh tranh với vi sinh vật gây

bệnh tại vùng rễ để làm giảm nguồn bệnh phát sinh từ đất và thúc đẩy sinh trưởng ở thực vật một cách trực tiếp dựa trên hoạt tính cố định N, phân giải P khó tan và sinh tổng hợp IAA. Sử dụng vi khuẩn vùng rễ làm chế phẩm vi sinh được coi là xu hướng trong tương lai vì nó làm giảm đáng kể việc sử dụng hóa chất, phân bón hoá học từ đó góp phần làm tăng năng suất, chất lượng sản phẩm một cách bền vững [16-26]. Hướng nghiên cứu về ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đến khả năng sinh trưởng và kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu còn được ít quan tâm ở Việt Nam và chưa có nghiên cứu nào một cách hệ thống trên cây hồ tiêu ở khu vực Tây Nguyên. Vì vậy, đề tài nghiên cứu “Tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính kháng tác nhân gây bệnh và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu ( Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên” là rất cần thiết.

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Tuyển chọn, xác định được đặc tính kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne và tạo chế phẩm phòng trừ bệnh rễ của các chủng vi khuẩn vùng rễ cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại Tây Nguyên.

3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân lập từ vùng rễ cây hồ tiêu tại Tây Nguyên, định danh các chủng có tiềm năng kháng Phytophthora, Fusarium và kháng tuyến trùng Meloidogyne gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu tại Tây Nguyên.

2. Nghiên cứu đặc tính và xác định hoạt chất kháng Phytophthora, Fusarium, tuyến trùng Meloidogyne của các chủng vi khuẩn tiềm năng được tuyển chọn.

3. Bước đầu tạo chế phẩm vi sinh phòng trừ nấm và tuyến trùng từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn.

4.Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

4.1. Ý nghĩa khoa học

Xác định một số chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng Phytophthora sp., Fusarium sp. và tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh rễ trên cây hồ tiêu đồng thời cung cấp dẫn liệu khoa học về khả năng đối kháng của một số chủng vi khuẩn làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn đối kháng làm chế phấm sinh học phòng trừ Phytophthora sp., Fusarium sp. và tuyến trùng Meloidogyne sp.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Góp phần vào việc tạo ra các chế phẩm sinh học để phòng trừ bệnh rễ do Phytophthora sp., Fusarium sp. và tuyến trùng Meloidogyne sp. gây nên nhằm ứng dụng các biện pháp sinh học phòng trừ bệnh rễ trên cây hồ tiêu có hiệu quả tốt và an toàn với môi trường tự nhiên và sức khỏe con người.

5. Phạm vi nghiên cứu

Vùng chuyên canh hồ tiêu của ba tỉnh Tây Nguyên là Đắk Lắk, Đắk Nông và Gia Lai.

Nghiên cứu phân lập, sàng lọc hoạt tính sinh học các chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kháng bệnh rễ trên cây hồ tiêu được thực hiện trong phòng thí nghiệm, các thực nghiệm nhà lưới.