MỤC LỤC
Chương Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Tóm tắt iii
Summary v
Mục lục vii
Có thể bạn quan tâm!
-
Nghiên cứu sự đa dạng và độc tính của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki trên sâu ăn lá hại rau ở Việt Nam - 1 -
Nghiên cứu sự đa dạng và độc tính của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki trên sâu ăn lá hại rau ở Việt Nam - 3 -
Sự Phân Bố Và Đa Dạng Quần Thể Của Vi Khuẩn Bacillus Thuringiensis -
Các Nghiên Cứu Trong Và Ngoài Nước Về Sự Phân Bố, Đa Dạng Di Truyền Của
Xem toàn bộ 262 trang tài liệu này.
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt xiv
Danh mục các bảng xvi
Danh mục các hình và đồ thị xxi
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3
3.1 Đối tượng nghiên cứu 3
3.2 Phạm vi nghiên cứu 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu 4
4.1 Ý nghĩa khoa học 4
4.2 Ý nghĩa thực tiễn 4
4.3 Những đóng góp mới của nghiên cứu 4
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1 Sự phân bố và đa dạng quần thể của vi khuẩnBacillus thuringiensis5
1.1.1 Phân loại vi khuẩn Bacillus thuringiensis 6
1.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 6
1.1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sự phân bố, đa dạng di truyền
của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 8
1.2 Độc tố gây hại côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 12
1.2.1 Phân loại độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 12
1.2.2 Gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 13
1.2.3 Gen cyt của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17
1.2.4 Protein vip của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17
1.2.5 Cơ chế tác động của Bacillus thuringiensis đối với côn trùng 19
1.2.6 Các nghiên cứu về Bacillus thuringiensis trong và ngoài nước 20
1.2.6.1 Nghiên cứu về gen cry 20
1.2.6.2 Nghiên cứu về khả năng chống chịu tia UV 21
1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối vi khuẩn
Bacillus thuringiensis 22
1.3 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong sản xuất nông nghiệp .24
1.3.1 Thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc Bacillus thuringiensis 25
1.3.2 Cây trồng chuyển gen vi khuẩn Bacillus thuringiensis 28
Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1 Nội dung nghiên cứu 30
2.1.1 Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis và đa dạng quần thể
Bacillus thuringiensis var. kurstaki từ các tỉnh, thành ở Việt Nam 30
2.1.2 Đánh giá độc tính của các chủng Bacillus thuringiensis var. kurstaki
trên sâu ăn lá 30
2.1.2.1 Đánh giá khả năng gây chết của các chủng Bacillus thuringiensis var.
kurstaki trên sâu ăn lá bộ cánh vảy 30
2.1.2.2 Chọn lọc chủng B. thuringiensis var. kurstaki kháng tia UV và
tối ưu điều kiện sản xuất chế phẩm VBt 30
2.1.2.3 Đánh giá hiệu quả trừ sâu ăn lá của chế phẩm VBt điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng 30
2.2 Thời gian và địa điểm 31
2.2.1 Thời gian 31
2.2.2 Địa điểm 31
2.3 Vật liệu nghiên cứu 31
2.3.1 Hóa chất thí nghiệm 31
2.3.2 Nguồn sâu 32
2.4 Phương pháp nghiên cứu 32
2.4.1 Sự phân bố của của vi khuẩn Bacillus thuringiensis và chọn lọc vi khuẩn
Bacillus thuringiensis var. kurstaki trong đất từ các tỉnh, thành 32
2.4.1.1 Phương pháp thu thập mẫu đất 32
2.4.1.2 Phương pháp đặt tên mẫu đất và chủng vi khuẩn (mã mẫu) 33
2.4.1.3 Phương pháp chuẩn bị môi trường phân lập mẫu đất 33
2.4.1.4 Phân lập mẫu vi khuẩn 33
2.4.1.5 Định danh vi khuẩn Bacillus thuringiensis bằng thử nghiệm hóa sinh ...34
2.4.1.6 Phương pháp tăng sinh khối vi khuẩn Bacillus thuringiensis 35
2.4.1.7 Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn Bacillus thuringiensis 35
2.4.2 Khuếch đại trình tự 16S-rDNA và gen cry của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki 36
2.4.2.1 Ly trích DNA 36
2.4.2.2 PCR 36
2.4.2.3 Điện di trên gel agarose và đọc kết quả sản phẩm PCR 37
2.4.3 Xác định sự hiện diện protein vip3a của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
var. kurstaki 37
2.4.3.1 PCR phát hiện gen vip3a 37
2.4.3.2 Phương pháp phân lập protein Vip3a 38
2.4.4 Đánh giá độc tính của các mẫu phân lập Bacillus thuringiensis var.
kurstaki sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu
xanh da láng (Spodoptera exigua) trong điều kiện phòng thí nghiệm 39
2.4.5 Xác định giá trị LC50, LT50 của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis
var. kurstaki 40
2.4.5.1 Xác định giá trị LC5040
2.4.5.2 Xác định giá trị LT5040
2.4.6 Chọn lọc chủng Bacillus thuringiensis var. kusrtaki chống chịu tia UV (Ultraviolet) 41
2.4.6.1 Khảo sát khả năng chống chịu tia UV của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kusrtaki ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm 41
2.4.6.2 Đánh giá hiệu quả gây chết sâu của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki có khả năng chống chịu tia UV trong điều kiện phòng thí nghiệm 41
2.4.7 Tối ưu điều kiện lên men của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
var. kusrtaki 42
2.4.7.1 Xác định môi trường dinh dưỡng phù hợp nhân sinh khối vi khuẩn 42
2.4.7.2 Khảo sát các điều kiện nhân sinh khối vi khuẩn Bacillus thuringiensis var.
kurstaki 43
2.4.7.3 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh khối của vi khuẩn bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 43
2.4.7.4 Đánh giá hiệu quả gây chết sâu khi kết hợp của các chủng vi khuẩn
Bacillus thuringiensis var. kurstaki 44
2.4.7.5 Khảo sát mức nhiệt độ bảo quản chế phẩm VBt 45
2.4.8 Khảo sát khả năng tăng sinh vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki
bằng hệ thống lên men tự động 2 lít BioFlo 120 45
2.4.9 Đánh giá độc tính của chế phẩm VBt trên trên sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) trong điều kiện nhà lưới 46
2.4.10 Đánh giá độc tính của chế phẩm VBt trên sâu tơ ngoài đồng ruộng 47
2.5 Xử lý và phân tích số liệu 47
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49
3.1 Phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis và chọn lọc vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki trong đất ở các tỉnh, thành Việt Nam 49
3.1.1 Phân bố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 49
3.1.2 Xác định chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis bằng thử nghiệm
sinh hóa 51
3.2 Xác định sự hiện diện gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var.
kurstaki 56
3.3 Xác định sự hiện diện gen vip3a của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var.
kurstaki 65
3.4 Khả năng gây chết sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki phân lập 66
3.5 Giá trị LC50, LT50 của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki đối với sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng trong điều kiện phòng thí nghiệm 72
3.5.1 Giá trị LC50, LT50 của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var.
kurstaki đối với sâu tơ 72
3.5.2 Giá trị LC50, LT50 của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var.
kurstaki đối với sâu khoang 74
3.5.3 Giá trị LC50, LT50 của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var.
kurstaki đối với sâu xanh da láng 76
3.6 Chọn chủng Bacillus thuringiensis var. kurstaki chống chịu tia UV .. 78
3.6.1 Khả năng chống chịu tia UV của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki ở bước sóng 254 nm và 365 nm 78
3.6.2 Hiệu quả gây chết sâu của các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis
var. kurstaki có khả năng chống chịu tia UV trong điều kiện phòng
thí nghiệm 82
3.7 Tối ưu điều kiện lên men của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var.
kurstaki 85
3.7.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh khối vi khuẩn 85
3.7.1.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sinh khối vi khuẩn 86
3.7.1.2 Ảnh hưởng của pH đến sinh khối vi khuẩn 86
3.7.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối vi khuẩn 87
3.7.2 Tối ưu hóa các yếu tố ảmh hưởng đến sinh khối của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm .88
3.7.3 Hiệu quả gây chết sâu khi kết hợp hai chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki 92
3.7.4 Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ bảo quản đến chế phẩm VBt 94
3.8 Tăng sinh vi khuẩn bằng hệ thống lên men tự động 2 lít BioFlo 120.. 95
3.9 Hiệu quả của chế phẩm VBt trên trên sâu tơ, sâu khoang và sâu xanh
da láng trong điều kiện nhà lưới 97
3.10 Hiệu quả của chế phẩm VBt đối với sâu tơ ngoài đồng ruộng 100
Thảo luận chung 103
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107
1. Kết luận 107
2. Đề nghị 108
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 109
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 131
PHỤ LỤC 1. 1
Sơ đồ định danh vi khuẩn của Bergey 1
Sơ đồ phân loại vi khuẩn Bacillus spp. 2
Ly trích DNA 3
Thuốc trừ sâu Vi-Bt®32000WP 4
Hình ảnh các hoạt động thực hiện Luận án 5
PHỤ LỤC 2. Giải trình tự các gen cry 14
PHỤ LỤC 3. Số liệu thí nghiệm 21
PHỤ LỤC 4. Phân tích thống kê 40
PHỤ LỤC 5. Số liệu địa điểm lấy mẫu 69
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Ý nghĩa
ATCC American Type Culture Collection Bp Base pair – Cặp base
Bt Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis)
Btk Bacillus thuringiensis var. kurstaki
BIOTEC National Center for Genetic Engineering and Biotechnology BVTV Bảo vệ thực vật
CNSH Công nghệ sinh học
Ctv Cộng tác viên
Cry Crystal
CV Coefficient of variation – hệ số biến thiên
Cyt Cytolitic
DNA Deoxyribonucleic acid
ĐC Đối chứng
ELISA Enzyme – Linked Immunosorbent Assay
FAO Food and Agriculture Organization – Quỹ lương nông quốc tế
GSXL Giờ sau xử lý
LC50 Lethal concentration – Nồng độ gây chết 50 % cá thể
LT50 Lethal time – Thời gian gây chết 50% cá thể NCBI National Center Biotechnology Information NSXL Ngày sau xử lý
NSP Ngày sau phun
NT Nghiệm thức
IPM Integrated Pest Management – Quản lý dịch hại tổng hợp