Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 Clade 7 phân lập ở Việt Nam - 12

Digg Facebook Google LinkedIn Pinterest Reddit Tumblr Twitter
1

Nội dung:


67 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008

52

94

94

83

91

A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008

A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/2008

Clade 7

83

35

A/chicken/Shanxi/10/2006 2006

A/chicken/Shandong/A-10/2006 2006

A/chicken/Shanxi/2/2006

Clade 7

33

33

A/Beijing/01/2003

A/chicken/Korea/es/2003

99

A/black-headed goose/Qinghai/1/2005

A/chicken/Bhutan/248006/2010 A/duck/India/TR-NIV4396/2008

A/duck/Hunan/1386/2003

99

14

59

55

58

27

A/Indonesia/239H/2005 A/Indonesia/CDC1046/2007 A/Indonesia/535H/2006

A/Ck/Indonesia/2A/2003 2003 A/chicken/East Java/UT6045/2007

A/duck/Guangxi/351/2004

96

28 80 A/chicken/Thailand/ICRC-7356/2010

68

53

34

51


53


66


74

31

A/Thailand/Kan353/2004 2004

A/duck/Vietnam/48/2004 2004 A/Cambodia/P0322095/2005

A/Vietnam/CL100/2004 A/duck/Vietnam/286/2005

A/Muscovy duck/Ca Mau/07-04/2007 A/chicken/Lang Son/200/2005 2005

A/duck/Guiyang/3834/2005 2005

A/Anhui/T2/2006 2006

46

77 A/Anhui/2/2005 2005

25

68

A/Shanghai/1/2006 2006

A/crested myna/Hong Kong/540/2006

41

99

97

33

A/Hong Kong/6841/2010 A/mallard/Korea/1195/2010

A/Hunan/1/2006

83

77 A/duck/Guangxi/150/2006

A/duck/Laos/P0117/2007

A/duck/Zhejiang/52/2000

A/goose/Fujian/bb/2003

100

A/goose/Vietnam/3/05 2005

99 A/Duck/Hong Kong/y283/1997 A/Hong Kong/156/1997

94

93

A/duck/Shantou/195/2001 A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001

A/Goose/Guangdong/1/96


0.002


Hình 3.5. Cây phả hệ dự t ên chuỗi nucleotide gen M củ c c chủng i A/H5N1 clade 7 (Được lập bằng phương ph p phân tích neighbo -joining sử dụng phần mề MEGA 5, gi t ị boostrap 1000)

Bảng 3.7. D nh ch c c chủng i c A/H5N1 ử dụng đ o nh à lập cây ph t inh loài dự t ên gen M


STT


D nh ph p q c tế

Loài

ắc

Nă phân

lập

Nơi phân lập

S đăng ký ngân hàng

gen

1

A/Goose/Guangdong/1/96

Ngỗng

1996

Trung Quốc

AF144306

2

A/Hong Kong/156/1997

Người

1997

Hong Kong

AF036358

3

A/Duck/Hong Kong/y283/1997

Vịt

1997

Hong Kong

AF098567

4

A/duck/Zhejiang/52/2000

Vịt

2000

Trung Quốc

AY585397

5

A/duck/Shantou/195/2001

Vịt

2001

Hong Kong

CY029002

6

A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001

2001

Trung Quốc

AF509048,

7

A/chicken/Korea/es/2003

2003

Hàn Quốc

EF541460

8

A/Ck/Indonesia/2A/2003

2003

Indonesia

AY651377

9

A/goose/Fujian/bb/2003

Ngỗng

2003

Trung Quốc

DQ997402

10

A/Beijing/01/2003

Người

2003

Trung Quốc

EF587280

11

A/duck/Hunan/1386/2003

Vịt

2003

Trung Quốc

CY029310

12

A/Thailand/Kan353/2004 2004

Người

2004

Thái Lan

EF541446

13

A/duck/Guangxi/351/2004

Vịt

2004

Trung Quốc

DQ320943

14

A/Vietnam/CL100/2004

Người

2004

Việt Nam

DQ492986

15

A/duck/Vietnam/48/2004 2004

Vịt

2004

Việt Nam

DQ492944

16

A/Cambodia/P0322095/2005

Người

2005

Cam pu

chia

HQ200461

17

A/Indonesia/239H/2005

Người

2005

Indonesia

EU146665

18

A/black-headed

goose/Qinghai/1/2005

Ngỗng

2005

Trung Quốc

DQ100567

19

A/Anhui/2/2005

Người

2005

Trung Quốc

CY060147

20

A/duck/Guiyang/3834/2005

Vịt

2005

Trung Quốc

EF124151

21

A/chicken/Lang Son/200/2005

2005

Việt Nam

GU186717

22

A/goose/Vietnam/3/05 2005

Ngỗng

2005

Việt Nam

DQ366317

23

A/duck/Vietnam/286/2005

Vịt

2005

Việt Nam

DQ492958

24

A/crested myna/Hong

Kong/540/2006

Chim

2006

Hong Kong

EF12405

25

A/Indonesia/535H/2006

Người

2006

Indonesia

EU146756

26

A/chicken/Shandong/A-10/2006

2006

Trung Quốc

HM172139

27

A/chicken/shanxi/10/2006

2006

Trung Quốc

HM172135.1

28

A/chicken/shanxi/2/2006

2006

Trung Quốc

DQ914817

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 162 trang: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 Clade 7 phân lập ở Việt Nam

Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút cúm A/H5N1 Clade 7 phân lập ở Việt Nam - 12



STT


D nh ph p q c tế

Loài

ắc

Nă phân

lập

Nơi phân lập

S đăng ký ngân hàng

gen

29

A/Anhui/T2/2006 2006

Người

2006

Trung Quốc

EU008577

30

A/Hunan/1/2006

Người

2006

Trung Quốc

CY060173

31

A/Shanghai/1/2006

Người

2006

Trung Quốc

AB462298

32

A/duck/Guangxi/150/2006

Vịt

2006

Trung Quốc

EF124078

33

A/chicken/East Java/UT6045/2007

2007

Indonesia

GQ122542

34

A/Indonesia/CDC1046/2007

Người

2007

Indonesia

CY019411

35

A/duck/Laos/P0117/2007

Vịt

2007

Lào

CY040921

36

A/Muscovy duck/Ca Mau/07-

04/2007

Ngan

2007

Việt Nam

GU186746

37

A/duck/India/Tr-NIV4396/2008

Vịt

2008

Ấn Độ

CY046105

38

A/chicken/Bhutan/248006/2010

2010

Bhutan

CY066007

39

A/mallard/Korea/1195/2010

Vịt

trời

2010

Hàn Quốc

HQ695916

40

A/Hong Kong/6841/2010

Người

2010

Hong Kong

HQ636463

41

A/chicken/Thailand/ICRC-

7356/2010

2010

Thái Lan

HM590792

Dựa trên phân tích cây phả hệ của gen chúng tôi có thể nhận xét r ng các chủng virus cúm gia cầm A H N1 thuộc clade 7 của Việt Nam có độ tương đồng cao và xắp xếp thành một nhóm với nhau, và n m trong nhóm với các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Trung Quốc. Kết quả phân tích này chứng tỏ gen M của các virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam và Trung Quốc có cùng nguồn gốc. Để thấy rõ hơn sự khác biệt di truyền mức độ nucleotide và axit amin, chúng tôi so sánh gen của các chủng virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam với một số virus cúm A/H5N1của Trung Quốc. Kết quả được biểu thị

bảng 3.8.

Mức độ sai khác về di truyền gen M giữa các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam với nhau gần như không đáng kể, c thể sự sai khác tối đa về mức độ nucleotide là 1% và mức độ axit amin là 0,6%.

Mức độ sai khác giữa các chủng virus cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Việt Nam và các chủng thuộc clade của Trung Quốc cũng rất thấp. Sự sai khác tối

đa về di truyền mức độ nucleotide và axit amin giữa các virus của 2 nhóm này lần lượt là 3,0±0.1% và 3,3±0.2% (virus A chicken/Shanxi/2/2006).

So sánh sự sai khác về di truyền giữa các chủng virus cúm thuộc clade do chúng tôi phân lập với các chủng virus thuộc clade khác trên cơ s gen , chúng tôi nhận thấy sự sai khác về nucleotide và axit amin không nhiều, chỉ trong khoảng 3,6% về nucleotide và 2-4% về axit amin. Duy chỉ có 2 chủng A goose Vietnam 3 0 và chủng A HongKong 1 6 9 thuộc clade 0 thì có sự khác biệt khá lớn: sự sai khác về mức độ nucleotide tới 10% và về mức độ axit amin tới 7%. Một chủng virus A H N1 khác cũng thuộc clade 0 là chủng A Goose Guangdong 1 96, được coi là thủy tổ của các chủng virus cúm A H N1độc lực cao, có độ sai khác về di truyền với các chủng virus thuộc clade

của Việt Nam mức độ nucleotide là ,3±0.2% ( ,2- ,6%) và mức độ axit amin là 4,2±0.2 % (4,1-4,4%).

Tóm lại, kết quả phân tích phát sinh loài, kết quả phân tích sự sai khác di truyền dựa trên gen H , N1 và của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam cho thấy, các chủng virus thuộc clade 7 của Việt Nam có độ tương đồng cao với nhau chứng tỏ chúng có cùng nguồn gốc, và tương đồng với các chủng virus A H N1 cũng thuộc clade phân lập Trung Quốc.

Từ các kết quả trên có thể kết luận r ng các chủng virus cúm A H N1 thuộc clade 7 của Việt Nam cùng nguồn gốc với các virus thuộc clade 7 của Trung Quốc, và xâm nhập vào Việt Nam chứ không phải là các virus tiến hóa từ các chủng virus cúm A H N1độc lực cao gây bệnh trước đó trên gia cầm (2003- 2008) tại Việt Nam. Hiện tượng các chủng virus thuộc clade được phát hiện vùng biên giới năm 2008, cùng với sự xuất hiện của nhiều clade khác Việt Nam như clade 2.3.4 và 2.3.2 Việt Nam rất giống với những chủng virus cúm A H N1 lưu hành và gây bệnh trên gia cầm Trung Quốc cho thấy nguy cơ xâm nhập và xuất hiện của các chủng virus cúm A/H5N1từ bên ngoài vào Việt Nam là rất lớn, vì vậy cần phải tăng cường công tác giám sát nh m phát hiện sớm những virus cúm A H N1có thể sẽ xâm nhập hoặc đang lưu hành trên gia cầm Việt Nam.


Bảng 3.8. So nh ức đ kh c biệt về di truyền t ên gen M của 5 chủng virus c A/H5N1 th c clade 7 so

nh ới m t s chủng tham chiếu


Ký hiệ chủng

Tên chủng i 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15


Axit amin (%)

1

A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008


0,6

0,3

0,3

0,3

1,6

1,3

3,5

1,9

7,4

1,9

2,1

3,8

4,4

7,4

2

A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008

1,0


0,3

0,3

0,3

1,6

1,3

3,5

1,9

7,4

1,9

1,8

3,8

4,4

7,4

3

A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008

0,9

0,3


0,0

0,0

1,3

0,9

3,2

1,6

7,1

1,6

1,8

3,5

4,1

7,1

4

A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008

0,9

0,3

0,2


0,0

1,3

0,9

3,2 https://tailieuthamkhao.com

1,6

7,1

1,6

1,8

3,5

4,1

7,1

5

A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008

0,9

0,3

0,2

0,0


1,3

0,9

3,2

1,6

7,1

1,6

1,8

3,5

4,1

7,1

6

A/chicken/Shandong/A-10/2006

1,3

1,3

1,2

1,2

1,2


0,9

3,8

1,6

7,4

1,6

1,8

3,5

4,4

7,4

7

A/chicken/Shanxi/10/2006

0,8

0,9

0,8

0,8

0,8

0,8


4,1

1,6

7,4

1,6

1,8

3,5

4,4

7,4

8

A/chicken/Shanxi/2/2006

3,1

3,1

2,8

2,9

2,9

2,8

3,0


3,2

7,4

3,2

3,5

5,1

5,8

7,4

9

A/Beijing/01/2003_2003

2,4

2,4

2,3

2,3

2,3

1,7

2,1

3,5


5,8

0,0

0,7

1,9

2,8

5,8

10

A/goose/Vietnam/3/05

10,0

10,1

9,7

9,7

9,7

10,0

10,4

9,3

8,7


5,8

5,7

5,8

3,8

0,0

11

A/Anhui/2/2005

3,0

3,1

3,0

3,0

3,0

2,4

2,7

4,0

0,9

8,1


0,7

1,9

2,8

5,8

12

A/blackheadedgoose/Qinghai/1/2005

3,2

3,2

3,2

3,2

3,2

2,6

2,7

4,0

1,4

9,3

1,3


2,1

3,2

5,7

13

A/goose/Fujian/bb/2003

4,0

4,1

3,8

3,8

3,8

3,4

3,7

4,4

2,1

8,1

2,0

2,3


2,8

5,8

14

A/Goose/Guangdong/1/96

5,5

5,6

5,2

5,2

5,2

5,0

5,3

5,7

3,5

6,0

3,4

3,8

3,2


3,8

15

A/Hong_Kong/156/97

10,7

10,8

10,5

10,5

10,5

10,7

11,1

9,3

9,4

1,3

8,8

9,8

8,8

7,5


Nucleotide (%)


83

3.3. X c định m t s đặc tính inh học của virus A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt N (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008)

3.3.1. Tính thích ứng t ên ph i gà (x c định ch s EID50)

Virus cúm nói chung và virus cúm gia cầm A/H N1 độc lực cao có khả năng phát triển tốt trên phôi gà, vì vậy phôi gà 9-10 ngày tuổi thường được sử d ng để phân lập virus cúm gia cầm độc lực cao trong công tác chẩn đoán cũng như để giữ giống virus. Tuy nhiên, các chủng virus cúm gia cầm có đặc điểm khác nhau khi nhân lên trên phôi trứng, thể hiện b ng sự gây nhiễm phôi, gây chết phôi và chuẩn độ tối ưu của virus khi nhân lên trên phôi trứng. Sự khác biệt về thời gian gây chết phôi trứng và chuẩn độ tối ưu của các chủng virus khác nhau là khác nhau. Virus có độc lực thấp thường giết chết phôi trứng chậm hơn và có thể thu được virus với nồng độ cao hơn so với virus cúm có độc lực cao và ngược lại.

Để xác định tính thích ứng của các chủng virus cúm gia cầm H5N1 clade

phân lập được, chúng tôi lựa chọn chủng A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 làm chủng đại diện vì chủng này có thể được coi là gần với chủng gốc thuộc clade có từ Trung Quốc.

Phôi trứng được lấy từ đàn gà khỏe mạnh chưa tiêm vacxin cúm gia cầm H N1, và không nhiễm virus cúm gia cầm trong tự nhiên để tránh tác động nếu có (trong lòng đỏ của phôi trứng) của kháng thể từ gà mẹ được tiêm phòng. Trứng được mua từ lúc 8 ngày tuổi và ấp tiếp 1 ngày để ổn định tại phòng thí nghiệm trước khi sử d ng cho thí nghiệm xác định sự thích nghi của chủng virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 trên phôi gà.

Chủng virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 đã được chia thành nhiều ống nhỏ sau khi phân lập và giữ nhiệt độ -860C. Trước khi tiến hành thí nghiệm hỗn dịch virus đã được kiểm tra vô trùng theo thường quy và được pha thành nhiều nồng độ từ 10-1 đến 10-8 b ng dung dịch đệm PBS có pH 7,2. Tiến hành gây nhiễm cho phôi trứng với 6 nồng độ pha loãng từ 10-3 đến 10-8 vào xoang niệu mô (allantoic cavity) của phôi trứng, mỗi nồng độ gây nhiễm cho

phôi với liều 100µl phôi, ấp tiếp nhiệt độ 370C, theo dõi 2 lần ngày cách nhau

khoảng 8 giờ trong vòng 4 ngày, loại phôi chết trước 24 giờ. Trong thí nghiệm này có sử d ng 3 phôi trứng tiêm dung dịch PBS làm đối chứng âm và ấp trong cùng điều kiện.

Các phôi trứng chết trong thời gian theo dõi được làm lạnh nhiệt độ 2 – 80C trong vòng 24 giờ cho mạch máu có lại và tiến hành mổ trứng thu hoạch dịch niệu mô. Những phôi trứng sống sau thời gian theo dõi (kể cả đối chứng âm tính) đều được thua dịch niệu mô và được kiểm tra b ng phản ứng HA để xác định khả năng nhiễm của virus trên phôi trứng và xác định chỉ số EID50 theo công thức Reed-Muench.

Trước khi gây nhiễm chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng các ống virus giống trên các môi trường: nước thịt, BHI, thạch thường, thạch máu, Sabauraud và nước thịt gan yếm khí, nh m m c đích xác định chắc chắn phôi trứng chết là do virus cúm gây ra. Chúng tôi kiểm tra phôi trứng hàng ngày 2 lần, cách nhau 8h để ghi nhận chi tiết về thời gian chết của phôi. Kết quả thời gian gây chết phôi trình bày bảng 3.9.

Kết quả xác định khả năng gây nhiễm trên phôi gà và chỉ số EID50 của chủng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 được trình bày bảng 3.10.

Bảng 3.9. Theo dõi thời gi n gây chết ph i


Đợt TN

Số phôi gây nhiễm

Theo dõi số phôi chết

Tổng số phôi chết

Tỷ lệ (%)

0-24 h

25-48 h

49-72 h

73-96h

1

30

0

10

5

5

20

67

2

30

0

10

5

4

19

63

3

30

0

10

5

4

19

63

Kết quả cho thấy: không có phôi chết trước 24 giờ, virus bắt đầu giết chết phôi trong vòng 2 ngày từ sau khi gây nhiễm. Điều này cũng phù hợp với các ghi nhận thường nhật khi chúng tôi tiến hành phân lập các mẫu có virus cúm gia cầm H N1 trên phôi trứng, và cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây (Easterday

và cs, 199 ; Wanasawaeng và cs, 2009) nhận xét r ng virus cúm độc lực cao thường giết chết phôi trứng trong vòng 48 giờ sau khi gây nhiễm (h.p.i – hour post-infection) lên xoang niệu mô.

Bảng 3.10. Kết quả theo dõi tỷ lệ s ng/chết của ph i trứng khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008



Lần thí nghiệm


Hiệu giá pha loãng

Số phôi gây nhiễm


Số phôi bị nhiễm

Số phôi không nhiễm

Số tích lũy

Tỷ lệ nhiễm virus (%)

A (A+B) × 100

Nhiễm virus (A)

Không nhiễm

(B)

Tổng cộng (A+B)


Lần 1

10-3

5

5

0

20

0

20

100

10-4

5

5

0

15

0

15

100

10-5

5

5

0

10

0

10

100

10-6

5

4

1

5

1

6

83.3

10-7

5

1

4

1

5

6

16.7

10-8

5

0

5

0

10

10

0

ĐC (-)

3

0

3





EID50/0,1ml

107 (theo công thức eed-Muench)


Lần 2

10-3

5

5

0

19

0

19

100

10-4

5

5

0

14

0

14

100

10-5

5

5

0

9

0

9

100

10-6

5

3

2

4

1

5

80.0

10-7

5

1

4

1

5

6

16.7

10-8

5

0

5

0

10

10

0

ĐC (-)

3

0

3





EID50/0,1 ml

106.9 (theo công thức eed-Muench)


Lần 3

10-3

5

5

0

19

0

19

100

10-4

5

5

0

14

0

14

100

10-5

5

5

0

9

0

9

100

10-6

5

3

2

4

1

5

80.0

10-7

5

1

4

1

5

6

16.7

10-8

5

0

5

0

10

10

0

ĐC (-)

3

0

3




0

EID50/0,1 ml

106.9 (theo công thức eed-Muench)

- Ở nồng độ pha loãng 10-3, toàn bộ phôi trứng chết trong vòng 40h sau khi gây nhiễm.

Bài viết tương tự

Gửi tin nhắn

Danh mục

Bài viết tương tự

Bài viết mới

Home | Contact | About | Terms | Privacy policy
© 2022 Tailieuthamkhao.com | all rights reserved

Trang chủ Tài liệu miễn phí